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目的: 研究蟾毒灵(Bufalin)抑制人大肠癌HCT116细胞增殖、诱导细胞凋亡以及和5-Fu的协同作用,并研究蟾毒灵抗大肠癌作用与IGF-PI3K/AKT信号通路的关系。 方法: 1、MTT法检测蟾毒灵、5-Fu以及两者联用对HCT116细胞增殖率的影响,分别计算半数抑制浓度(IC50);检测两种药物的协同作用;流式细胞法(FCM)检测蟾毒灵及5-Fu对细胞周期的影响和诱导细胞凋亡;HE染色观察蟾毒灵及5-Fu对HCT116细胞形态的影响。 2、蟾毒灵作用HCT116细胞后,实时荧光定量PCR法检测IGF-2mRNA和IGF-1RmRNA水平变化;westernblot和免疫细胞化学检测IGF-2和IGF-1R蛋白水平变化。 3、MTT法检测LY294002和蟾毒灵对大肠癌HCT116细胞抑制率的影响;Westernblot和免疫细胞化学法检测蟾毒灵作用HCT116细胞后,PI3K/AKT信号通路关键因子AKT和p-AKT的蛋白水平变化。 结果: 1、蟾毒灵能够抑制大肠癌HCT116细胞增殖,抑制率和药物浓度呈正相关。蟾毒灵对HCT116细胞24,36,48,60,72h的IC50分别为0.79±0.10,0.37±0.07,0.25±0.03,0.17±0.02,0.10±0.03μmol/L,IC50随着作用时间延长明显下降,和作用时间存在明显相关性。5-Fu能够抑制大肠癌HCT116细胞增殖,抑制率和药物呈正相关。计算出5-Fu对HCT116细胞48h的IC50为28.25±2.88μmol/L。 2、蟾毒灵3,0.3和0.03μmol/L分别作用HCT116细胞48h后,流式细胞术结果显示G2/M期细胞百分比增多,提示蟾毒灵诱导G2/M期阻滞,凋亡细胞明显增多,凋亡细胞随剂量增大而增多。5-Fu30μmol/L作用48h后,蟾毒灵作用后凋亡细胞明显增多,S期百分比增多,将细胞阻滞在S期。蟾毒灵和5-Fu两药联用后,将细胞阻滞在S期,S期所占的比例为55.48±4.65%,高于蟾毒灵0.3μmol/L组的26.21±7.06%,低于5-Fu组的66.66±1.16%,和对照组比较有统计学意义(P<0.05) 3、蟾毒灵作用后,HCT116细胞数量明显减少,体积缩小,皱缩,和药物浓度呈正相关。5-Fu组细胞密度减少,体积缩小,细胞仍呈多角形、长梭形。蟾毒灵+5-Fu组HCT116细胞形态变化不明显,仍呈多边形、长梭形生长。 4、蟾毒灵和5-Fu对抑制大肠癌HCT116细胞增殖有协同作用。等高线法计算出固定剂量组5-Fu浓度分别为5,10,15μmol/L时,对应的蟾毒灵IC50分别是0.045±0.018,0.036±0.012,0.022±0.007μmol/L,三个联用组都在叠加线的左下方,表示为协同作用。固定比例组的IC50的Buf为0.053±0.012μmol/L,Fu为5.3±1.2μmol/L,也在叠加线的左下方,表示为协同作用。联合指数法(CI法)显示CI值均小于1,提示两种药物联用时有协同作用,结论和等高线法相同。 5、蟾毒灵0.3μmol/L作用48h后,IGF-1RmRNA水平的表达明显上调,而蛋白水平在westernblot和免疫细胞化学中都明显下调,和对照组比较均有统计学意义(P<0.05);但IGF-2mRNA水平表达轻度上调,和对照组比较没有统计学意义,IGF-2蛋白水平表达明显上调,和对照组比较有统计学意义(P<0.05)。 6、蟾毒灵能够抑制大肠癌HCT116细胞增殖,LY294002能够增强这种抑制作用。LY294002预孵育对HCT116细胞增殖影响较小,而孵育48h对细胞增殖有明显抑制作用。预孵育组抑制率和药物浓度呈正相关,但都小于50%;共孵育组抑制率和药物浓度明显相关,48h的IC50为24.58±2.97μmol/L。经典等高线法显示LY294002为10,15,20μmol/L的三个联用组都在叠加线的左下方,表示为协同作用;LY294002为5μmol/L组在叠加线上,为相加作用;固定比例组在叠加线左下方,为协同作用。在固定剂量组和固定比例组中,两种药物联用后的IC50点大部分在叠加线的左下方,显示有协同作用。 7、蟾毒灵能够明显降低大肠癌HCT116细胞总AKT以及两种磷酸化AKT的蛋白表达。WesternBlot和免疫细胞化学结果显示,蟾毒灵0.3μmol/L作用于HCT116细胞48h后,总AKT和两种磷酸化AKT的蛋白表达有明显下降,和对照组比较均有统计学意义(P<0.05)。LY294002和蟾毒灵共同作用于大肠癌HCT116细胞后,总AKT以及两种磷酸化AKT的蛋白表达也明显下降。WesternBlot和免疫细胞化学结果显示,LY294002预孵育后加用蟾毒灵,以及和蟾毒灵共孵育两种作用方式,总AKT以及两种磷酸化AKT的蛋白表达明显下降,和对照组比较均有统计学意义(P<0.05)。 结论: 1、蟾毒灵能够抑制大肠癌HCT116细胞增殖,呈时间依赖性和剂量依赖性。5-Fu以剂量依赖性方式抑制HCT116细胞增殖。蟾毒灵和5-Fu对抑制HCT116细胞增殖有协同作用。两药联用后各自的药物浓度只要达到以前的五分之一就可以达到单种药物的作用效果。换言之,加用蟾毒灵后,可以大幅度的减少5-Fu的使用剂量。蟾毒灵作用于HCT116细胞后诱导G2/M期阻滞,5-Fu诱导S期阻滞,蟾毒灵和5-Fu两药联用诱导S期阻滞。5-Fu对大肠癌HCT116细胞的影响可能起主要作用,而蟾毒灵增强5-Fu的作用。 2、蟾毒灵诱导大肠癌HCT116细胞凋亡可能的机制是蟾毒灵的作用靶点在IGF-1R蛋白水平,下调IGF-1R蛋白的表达,反应性的上调了IGF-1RmRNA的表达,上调了IGF-2蛋白水平的表达。蟾毒灵能够抑制大肠癌HCT116细胞增殖,LY294002能够增强这种抑制作用。蟾毒灵能够明显下调大肠癌HCT116细胞总AKT和两种磷酸化AKT的蛋白表达,提示蟾毒灵诱导HCT116细胞凋亡的作用机制可能包括抑制AKT的蛋白表达和抑制AKT的磷酸化。蟾毒灵诱导大肠癌HCT116细胞凋亡的主要作用机制可能和IGF-PI3K/AKT信号通路有关。