论文部分内容阅读
肾藏精,主生殖;肝藏血,主疏泄。基于以下三方面:一是“肝肾同源理论”:肾藏精,肝藏血,血的化生有赖于肾中精气的气化;肾中精气的充盛,亦有赖于血的滋养。二是肾肝为母子之脏,母病可累及子病,子病可累及母病,临床对于妇科疾病的治疗,每每以肾为先,肝肾并治。三是中医肾、肝与月经周期的关系:肾气的开阖藏泻决定着冲任血海的充盈溢泄,从而形成月经周期。肝主疏泄,与肾主封藏之间,存在着相互制约、相反相成的关系。肝疏泄功能正常,女子定期才有月经的排泄。因此,肾肝与月经不调关系密切。月经先后不定期、经量过多、经期延长、崩漏等月经不调以及由此导致的不孕症皆与子宫内膜修复异常有关系。临床从肾肝辨治月经失调取得了明显的疗效。1984年FinnCA等用人工刺激子宫蜕膜化后撤退孕酮,使得小鼠子宫发生月经样改变,建立了第一个小鼠月经模型,对研究子宫内膜的变化建立了平台。我们前期预试验利用激素序贯法复制小鼠月经模型,并观察了激素撤退后0h、8h、12h、16h、24h、32h、40h、48h、72h的小鼠子宫内膜组织形态学周期变化,结果显示小鼠子宫内膜变化均有人类增殖期、分泌期、崩解及修复的特征。12-16小时子宫内膜开始崩解,24h出血强度最大且伴随着子宫内膜的初始修复,72h子宫内膜完全修复。为进一步探究肾肝对子宫内膜修复的影响机制,我们选取24h、32h、40h、48h、72h为观察点,比较了补肾方、调肝方、补肾调肝方(补肾方+调肝方)三方对小鼠月经模型子宫内膜修复的影响。第一部分补肾、调肝方对小鼠月经模型子宫内膜修复形态学的影响目的:观察比较补肾、调肝方对小鼠月经模型子宫内膜修复形态学的影响。方法:C57BL/6J雌性小鼠7-8周龄200只,采用随机数字表法分为4组:对照组,补肾组,调肝组、补肾调肝组(补肾方+调肝方组),每组50只。复制小鼠月经模型:行双侧卵巢切除术后恢复1周,在第1-3d皮下注射100ng雌二醇(E2);第7d将孕酮(P)皮埋管埋植于小鼠背部皮下,同时皮下注射50ngp和5nge2;第8-9d,继续皮下注射5nge2;在第9d的11:30,将15μl过滤除菌的花生油注射到小鼠右侧子宫角以诱导蜕膜化,未注射花生油的一侧子宫角作为对照,同时记录每只小鼠花生油注射的时间。蜕膜化诱导49h后,取出孕酮皮埋管(将此时间点作为孕酮撤退的0h)。各实验组在第10d分别给予补肾方、调肝方、补肾调肝方0.4ml灌胃,对照组用等容积蒸馏水,至第14d结束。在24h、32h、40h、48h、72h处死小鼠,取血,检测各组血清e2水平,取下子宫角,拍照,组织切片进行观察并评分。结果:1各组小鼠在孕酮撤退后24h、32h、40h、48h、72h血清e2水平的比较1.1同一组不同时间点血清e2水平对照组血清e2水平,24h、32h均高于48h(p<0.05),而48h高于72h(p<0.05)。补肾组呈逐渐升高趋势,48h、72h均高于24h(p<0.05)。调肝组24h分别高于32h、40h(p<0.05)。补肾调肝组32h达高峰(p<0.05)。1.2同一时间点不同组间血清e2水平比较与对照组比较,24h、40h,补肾组、调肝组、补肾调肝组血清e2水平均显著降低(p<0.05)。32h,补肾组、调肝组显著降低(p<0.05),而补肾调肝组显著升高(p<0.05);各实验组比较,24h,补肾组最低(p<0.05);在32h,补肾调肝组最高(p<0.05)。2各组小鼠在孕酮撤退后24h、32h、40h、48h、72h子宫内膜修复形态学评分比较2.1同一组不同时间点子宫内膜修复形态学评分各组子宫内膜形态学评分均于48h、72h达到最高(p<0.05)。2.2同一时间点不同组间子宫内膜修复形态学评分比较随时间的延长,补肾组子宫内膜形态学评分高于补肾调肝组,后者高于调肝组,均有统计学意义(p<0.05),而调肝组与对照组无统计学差异(p>0.05)。结论:实验结果表明,e2水平高低对子宫内膜修复无明显影响。补肾方、补肾调肝方均能促进子宫内膜修复,补肾方优于补肾调肝方。调肝方对子宫内膜修复无明显影响。第二部分补肾、调肝方对小鼠月经模型子宫内膜cxcl2、bcl-2影响的比较目的:探讨补肾方、调肝方、补肾调肝方对小鼠月经模型子宫内膜cxcl2、bcl-2蛋白表达的影响,以比较三方影响子宫内膜修复的机制。方法:动物分组及取材同第一部分。子宫角一部分取出浸入4%多聚甲醛固定,剩余部分冻存液氮,然后-80℃放置备测。分别采用免疫组化sp法和westernblot检测cxcl2、bcl-2蛋白的表达。结果:1各组小鼠在孕酮撤退后24h、32h、40h、48h、72h子宫内膜cxcl2蛋白的表达1.1同一组不同时间点子宫内膜cxcl2蛋白的表达在孕酮撤退后24h、32h、40h、48h、72h,各组子宫内膜cxcl2蛋白表达均于32h、48h达高峰(p<0.05)。1.2同一时间点不同组间cxcl2蛋白表达的比较与对照组比较,各个时间点,补肾组、调肝组和补肾调肝组子宫内膜cxcl2蛋白表达均显著升高(p<0.05);各实验组比较,24h、48h、72h,补肾组、调肝组、补肾调肝组依次显著降低(p<0.05),补肾调肝组32h最低,40h最高(p<0.05)。2各组小鼠在孕酮撤退后24h、32h、40h、48h、72h子宫内膜bcl-2蛋白的表达2.1同一组不同时间点子宫内膜bcl-2蛋白的表达各组bcl-2蛋白表达呈先升高后降低的趋势,48h达高峰(p<0.05)。2.2同一时间点不同组间bcl-2蛋白表达的比较与对照组比较,各个时间点,补肾组、调肝组和补肾调肝组子宫内膜bcl-2蛋白表达均升高;各实验组比较,24h,补肾调肝组最低(p<0.05)。32h,调肝组、补肾组、补肾调肝组依次显著降低(p<0.05)。40h,补肾调肝组最高(p<0.05)。48h,补肾组、调肝组、补肾调肝组依次显著降低(p<0.05)。72h,补肾组最高(p<0.05)。结论:补肾方、补肾调肝方对小鼠月经模型子宫内膜内膜修复影响的作用机制相似,二者均能通过上调小鼠子宫内膜cxcl2和bcl-2的蛋白表达,在调节炎性反应因子方面影响子宫内膜修复,尤以补肾方更为明显。可能与其不仅能增加cxcl2、bcl-2蛋白的表达,且能维持较长时间有关。调肝方虽能上调小鼠子宫内膜cxcl2和bcl-2蛋白表达,但未能加快子宫内膜修复。第三部分补肾、调肝方对小鼠月经模型子宫内膜vegf、ang-2、vegfr2蛋白表达影响的比较目的:探讨补肾方、调肝方、补肾调肝方对小鼠月经模型子宫内膜vegf、ang-2、vegfr2蛋白表达的影响,以比较三方影响子宫内膜修复的机制。方法:动物分组及取材同第二部分。分别采用免疫组化sp法检测vegf、ang-2、vegfr2蛋白的表达,westernblot检测vegf、ang-2蛋白的表达。结果:1各组小鼠在孕酮撤退后24h、32h、40h、48h、72h子宫内膜vegf蛋白的表达1.1同一组不同时间点子宫内膜vegf蛋白的表达各组vegf蛋白表达呈先升高后降低的趋势,48h达高峰(p<0.05)。1.2同一时间点不同组间子宫内膜vegf蛋白表达的比较与对照组比较,各个时间点,各实验组子宫内膜vegf蛋白表达均升高;各实验组比较,24h,调肝组、补肾组、补肾调肝组是显著降低(p<0.05)。32h,调肝组最低(p<0.05)。40h,补肾调肝组、调肝组、补肾组依次显著降低(p<0.05)。48h,补肾调肝组最低(p<0.05)。72h,补肾组最高(p<0.05)。2各组小鼠在孕酮撤退后24h、32h、40h、48h、72h子宫内膜ang-2蛋白的表达2.1同一组不同时间点子宫内膜ang-2蛋白的表达对照组ang-2蛋白表达呈先升高后降低的趋势,48h达高峰(p<0.05)。2.2同一时间点不同组间ang-2蛋白表达的比较与对照组比较,各个时间点,各实验组子宫内膜ang-2蛋白表达均升高;各实验组比较,24h,调肝组最高(p<0.05)。32h,补肾组、补肾调肝组、调肝组依次显著降低(p<0.05)。40h,补肾调肝组最高(p<0.05)。48h、72h,补肾组、调肝组、补肾调肝组依次显著降低(P<0.05)。3各组小鼠在孕酮撤退后24h、32h、40h、48h、72h子宫内膜VEGFR2蛋白的表达3.1同一组不同时间点子宫内膜VEGFR2蛋白的表达各组VEGFR2蛋白表达呈先升高后降低的趋势,48h达高峰。(P<0.05)。3.2同一时间点不同组间VEGFR2蛋白表达的比较与对照组比较,各个时间点,各实验组子宫内膜VEGFR2蛋白表达均升高;各实验组比较,24h,调肝组最高(P<0.05),而32h,调肝组最低(P<0.05)。40h,补肾组最低(P<0.05)。48h,补肾调肝组最低(P<0.05)。72h,补肾组最高(P<0.05)。结论:补肾方、补肾调肝方均能通过上调子宫内膜VEGF、Ang-2、VEGFR2蛋白表达,加快子宫内膜修复。其作用机制可能是二方通过上调小鼠子宫内膜VEGF进一步影响CXCL2、Bcl-2、Ang-2、VEGFR2蛋白表达加快了子宫内膜修复。补肾方对于子宫内膜修复优于补肾调肝方,其作用机制可能与补肾方不仅能增加子宫内膜VEGF、Ang-2、VEGFR2蛋白表达且持续较长时间有关。调肝方虽在各个时间点上调VEGF、Ang-2、VEGFR2蛋白的表达,但未能促进子宫内膜修复。