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植物源天然产物是新农药创制的重要途径之一。透骨草（Phryma leptostachya）是一种多年生草本植物,作为传统杀虫植物在东亚地区长期用于害虫防治,其含有多种高杀虫活性的木脂素类化合物,尤其是双氧木脂素A（（+）-haedoxan A）对双翅目和鳞翅目害虫具有极高的杀虫活性。前期研究也表明双氧木脂素A具有显著的选择性和低细胞毒性,对人类和高等动物相对安全。因此,开发以双氧木脂素A为主要杀虫活性成分的植物源杀虫剂具有广阔前景。然而,和大多数植物源天然产物开发过程中遇到的问题一样,资源短缺是制约双氧木脂素A产业化的瓶颈。传统的双氧木脂素A获取方式是从透骨草根中直接提取分离,但双氧木脂素A仅在透骨草这一种植物中发现,且含量极低,因此依靠这种获取方式来生产农药并不可行。尽管已经通过化学方法全合成了双氧木脂素A,但其苛刻的反应条件以及超过20步合成步骤,致使其也无产业化可能。随着合成生物学的兴起,基于“自下而上”的策略达到“建物致用”的目的是破解植物资源不足的最有效方法之一,并且已在解决青蒿素和紫杉醇资源供给方面取得巨大成功,而生物合成途径的解析是开展合成生物学研究的前提和基础。目前,关于双氧木脂素A生物合成的研究极少,仅有一个可能参与其生物合成的细胞色素P450（Pl CYP81Q38）被报道,且公共数据库中还没有透骨草的基因组和转录组数据。鉴于此,本研究在对透骨草不同组织进行转录组测序的基础上,采用生物信息学预测可能参与双氧木脂素A生物合成的候选基因,重点解析了双氧木脂素A生物合成途径中参与结构后修饰反应的细胞色素P450（cytochrome P450,P450）和氧甲基转移酶（O-methyltransferase,OMT）的功能,主要结果如下:1.采用HPLC、LC-MS等方法明确透骨草代谢的木脂素类化合物累积的主要部位为根组织,以此为依据运用比较转录组学策略并结合二代、三代高通量测序技术完成了透骨草不同组织部位的转录组测序,以三代Pac Bio测序结果获得的72,796条全长转录本作为无参考基因组透骨草的参考转录组数据库,以二代BGISEQ-500平台分别对透骨草根、茎和叶组织进行测序,共检测到68,536条转录本,与Pac Bio参考基因集的平均比对率为77.48%。分析双氧木脂素A生物合成上游基因发现,在37个涉及松柏醇生物合成的差异表达基因中有22个在根组织上调表达,Pl CYP81Q38也在根组织特异性表达,这些基因的表达模式与木脂素类化合物的累积模式基本一致。再以Pl CYP81Q38的组织表达模式共表达筛选下游基因,获得18个P450s和15个OMTs作为候选基因进行下一步研究。2.利用透骨草幼苗底物饲喂试验确定芝麻素（（+）-sesamin）为透骨草中木脂素类化合物生物合成的关键前体,通过代谢谱分析发现饲喂芝麻素后可以生成两个产物,LC-HRMS初步推测两个产物均为芝麻素的先羟基化后甲基化产物。接着,成功在酿酒酵母中表达了前期筛选到的14个P450s,结合全细胞催化和体外生化试验明确透骨草中催化芝麻素向下一步反应的为一个新P450酶Pl CYP706AA1。进一步对其反应产物进行分离纯化和结构鉴定,确定Pl CYP706AA1催化芝麻素生成了两个产物,即芝麻素酚（（+）-sesaminol）和（+）-sesamin-2-ol,其中芝麻素酚为主产物。3.发现了3个透骨草内源的NADPH-细胞色素P450还原酶（Pl CPRs）,并利用原核表达和体外酶学试验初步明确3个Pl CPRs均具有电子传递功能。然后采用酿酒酵母全细胞催化体系确定3个Pl CPRs皆可以提高Pl CYP706AA1的催化效率,其中Pl CPR2与Pl CYP706AA1的匹配度最高,使产物芝麻素酚和（+）-sesamin-2-ol的总产量提高3倍以上,即摇瓶中产物总生成量由3.00 mg/L提升至最高9.40 mg/L。另外,普适性试验表明Pl CPRs还可以提高Pl CYP81Q38和芝麻Si CYP92B14的催化活性。4.克隆了8个透骨草OMTs基因（PlOMTs）,并成功在大肠杆菌中异源表达出其中7个可溶的重组Pl OMTs蛋白。体外酶学试验表明Pl OMT2对两个底物芝麻素酚和（+）-sesamin-2-ol的催化活性最高,对产物分离纯化和结构鉴定后确定Pl OMT2将上述两个底物分别甲基化生成（+）-sesangolin和1,3-benzodioxole,5-[4-（1,3-benzodioxol-5-yl）tetrahydro-1H,3H-furo[3,4-c]furan-1-yl]-4-methoxy-,[1S-（1α,3aα,4α,6aα）]-（9CI）。同时还证明了前期LC-HRMS的推测,明确Pl OMT2反应生成的两个甲基化产物与透骨草幼苗饲喂芝麻素生成的两个产物相同。5.RT-qPCR分析表明新发现的基因PlCYP706AA1、Pl OMT2和Pl CPRs与已报道的Pl CYP81Q38基因具有高度相似的时空表达模式,即在透骨草六叶期以后的根组织高水平表达,而根组织又是木脂素类化合物的主要累积场所,这就表明透骨草中木脂素类化合物的合成可能与累积场所一致,即主要发生在透骨草的根部。综上,本研究基于合成生物学理念,通过天然产物化学、转录组学、分子生物学、生物化学等手段开展了透骨草中双氧木脂素A生物合成途径解析,明确根组织为透骨草代谢的木脂素类化合物的主要累积场所,完成了透骨草的第一份转录组测序,鉴定到2个参与木脂素类化合物生物合成的新酶Pl CYP706AA1和Pl OMT2,并获得了可以提高Pl CYP706AA1催化效率的3个Pl CPRs。基于以上结果,成功揭示了透骨草中木脂素类化合物生物合成途径的两步反应,即以芝麻素为底物推进两步后续主要反应生成（+）-sesangolin,为下一步全面解析双氧木脂素A生物合成途径以及今后利用微生物生产双氧木脂素A破解植物源农药开发中资源短缺的瓶颈实现其产业化奠定基础。