目的选择接受人工辅助生殖治疗的患者人群,采用现况研究法,分析反复植入失败（recurrent implantation failure,RIF）的患病率和影响因素;在此基础上,应用单细胞测序、流式细胞术、原位杂交、免疫荧光、3D成像和生物信息学等方法,对小鼠子宫周细胞的特征及其调控子宫早期发育、妊娠早期和围植入期等不同时期子宫的功能进行研究,探究其参与RIF发生的可能机制,包括子宫周细胞分布、标志物、基因表达、信号通路及对炎症的免疫应答等;另外,发现妊娠早期子宫周细胞的特异性分子标志物。研究结果将为进一步揭示RIF病因及机制奠定基础,为发现RIF诊断和治疗手段提供新的依据。方法1应用现况研究方法,分析2018年1月至2020年12月在某市妇幼保健院生殖医学科接受ART治疗的3318个周期中女性患者临床资料,计算RIF患病率,并对比分析RIF患者周期与非RIF患者周期及≥3次周期临床妊娠不同结局患者临床资料的差异。2利用全组织免疫染色、组织透明和双光子3D成像技术观察新生小鼠子宫发育早期子宫周细胞的动态分布,验证子宫发育早期不同周细胞标志物的表达情况。经10X Genomics平台进行单细胞分离,对周细胞进行单细胞测序,预测子宫周细胞不同于其他组织周细胞的异质性,并使用免疫荧光染色（IF）方法对预测结果进行验证。3选取成年CD1雌性小鼠16只,按照不同处理分为5组,妊娠第四天（D4）野生型对照组（D4＿WT组）4只、D4＿LPS3h组（D4上午7时注射脂多糖（LPS）,D4上午10时取材）4只、D4＿LPS24h组（D3上午10时注射LPS,D4上午10时取材）4只、D5＿IS组（D5野生型小鼠的植入位点子宫基质细胞）4只、D5＿NIS组（D5＿IS组同一只鼠的非植入位点子宫基质细胞）4只。通过流式细胞荧光分选技术（FACS）获取不同处理组的子宫周细胞并进行RNA-seq。通过对差异基因进行GO、KEGG、GSEA等分析,预测子宫周细胞在围植入期可能发挥的功能。4选取不同组织中周细胞的标志性表达基因进行原位杂交（ISH）实验验证,研究子宫周细胞除NG2以外的特异性分子标志物。结果1在3318个周期中,非RIF组3184个周期,RIF组134个周期,RIF患病率为4.04%。不同周期中孕妇年龄的增加、低抗缪勒氏管激素（AMH）值和获卵总数为RIF的影响因素,其OR（95%CI）值分别为1.127（1.081～1.175）、0.845（0.739～0.965）、0.888（0.827～0.953）,P值均小于0.05。不同周期中孕妇年龄的增加、低子宫内膜厚度为≥3次周期患者临床妊娠的影响因素,其OR（95%CI）值分别为1.098（1.015～1.188）、0.786（0.665～0.929）,P值均小于0.05。2小鼠新生第一天（PND1）NG2阳性的周细胞出现在CD31阳性的内皮细胞周围,提示子宫周细胞在子宫发育早期就已存在。NG2可对早期妊娠D1～D8的周细胞进行标记。妊娠早期D1～D8已有表达ERα和PR的子宫周细胞,并且肝脏、心脏等组织中并不明显。3 FACS获得的子宫周细胞具有特异性。RNA-seq结果表明,围植入期子宫不同部位和不同LPS刺激时长子宫周细胞转录本具有较大差异。不同处理组组间差异较小,样本平行性较好。与D4＿WT组相比,D4＿LPS3h组和D4＿LPS24h组子宫周细胞上调表达的基因主要功能表现为炎症相关通路的富集,如天然免疫调节、防御反应的正向调节、细胞因子信号、细胞因子正调控、对LPS响应、白细胞迁移、细胞因子与受体相互作用和趋化因子等信号通路都显著富集。而下调表达的基因主要集中在维持周细胞正常生理通路的富集,如胞外基质组成、胶原纤维组成、肌肉迁移、肌肉收缩等。与D4＿WT组相比,D5＿IS组上调基因主要富集在增殖相关功能和信号通路中。通过Ed U染色的结果进一步证实了这一结论,D4＿WT组Ed U和NG2双阳性的细胞占NG2阳性子宫周细胞的比例只有4.32%,而这一比例在D5＿IS组高达29.98%。此外,与D5＿NIS组相比,D5＿IS组子宫周细胞中下调基因集主要富集在维持血管完整性的功能和信号通路。如血管发育调控、细胞粘附连接的正向调控、细胞连接组装、内皮细胞迁移、血管通透性调节等。这提示D5植入位点子宫周细胞可能参与调控了血管通透性的上调。4 ISH验证结果显示,虽然这些周细胞标记物中均可以在妊娠早期标记子宫周细胞,但其中一些分子在肌层或基质中具有非特异性信号,如Cox4i2、Kcnj8、Foxs1。与此相对,Rgs5在肌层未见表达,并且该分子在妊娠早期子宫中的表达模式与NG2类似。结论1调查地区RIF患病率为4.04%。不同周期中孕妇年龄的增加、低AMH值和获卵总数为RIF的影响因素;不同周期中孕妇年龄的增加、低子宫内膜厚度为≥3次周期患者临床妊娠的影响因素。2子宫周细胞形成于子宫发育早期。与其它组织中的周细胞相比,子宫周细胞具有一定的异质性。NG2在子宫发育早期和妊娠早期可对子宫周细胞进行标记。子宫周细胞在妊娠早期可以表达雌激素受体和孕激素受体,这提示子宫周细胞可能通过表达雌激素受体和孕激素受体调控子宫内膜厚度及子宫血管渗透性,从而参与了正常植入和反复植入失败的发生过程。3 D5植入位点的子宫周细胞不仅具有较强增殖能力,而且具有调节血管通透性的功能。此外,妊娠早期子宫周细胞也可对LPS刺激做出响应,参与炎症反应。子宫周细胞在围植入期的功能对于正常植入和反复植入失败的调控可能发挥重要作用。4 Rgs5可以作为妊娠早期子宫周细胞的一个重要标志基因。Tbx2可能是子宫周细胞中特异的转录调控因子。图 31 幅;表 24 个;参 354 篇。