研究发现绝经是心血管疾病发病率和死亡率上升的独立危险因素。女性绝经前、后心血管病特别是冠心病发病存在明显的差异，绝经前女性冠心病发病率极低，而绝经后发病率急剧升高，达到绝经前的4倍余，与之相伴随的是雌激素水平严重降低，比绝经前降低约45％，而患冠心病的绝经后妇女雌激素降低最为严重，约比绝经前降低72％，这提示雌激素对心血管系统具有保护作用，而近几十年的研究也证实雌激素对心血管系统的许多作用确实有助于防止或延缓冠心病的发生。雌激素具有广泛的生殖系统外作用，对心血管系统的作用涉及动脉粥样硬化发生的多个方面，已报道的有降低低密度脂蛋白（LDL）、升高高密度脂蛋白（HDL）、抗氧化及改善血管内皮功能等。尽管多方面的研究证实雌激素对心血管系统具有保护作用，但雌激素的缺陷在于会刺激乳腺和子宫组织增生，长期应用会增加乳腺癌和子宫内膜癌的发病风险，因而雌激素用于绝经妇女冠心病的防治是不现实的，寻找保留其有利作用、克服其不良影响的药物十分必要。选择性雌激素受体调节剂（Selective EstrogenReceptor Modulator，SERM）是几类化学结构并不相同但都能与雌激素受体结合的化合物，结合后的配体受体复合物的空间构象不尽相同，其作用具有组织特异性，在有些组织表现为类雌激素样作用而在有些组织表现为抗雌激素样作用，其中第二代SERM雷洛昔芬（Raloxifene，Ral）是非类固醇类、苯并噻吩类化合物，结构中的2-芳香苯噻吩核和雌激素受体结合，起17β-雌二醇的作用，而六氢毗啶侧链与抗雌激素样效应有关。研究发现雷洛昔芬对血脂代谢和骨骼组织的影响表现为雌激素样效应，但对乳腺和子宫表现为抗雌激素样效应，不促进乳腺和子宫组织增生，不会引起乳腺癌和子宫内膜癌。研究还发现雷洛昔芬的心血管作用与雌激素也不尽相同，如二者均能降低血清总胆固醇，但雷洛昔芬不能升高HDL，而在降低血清纤维蛋白原方面作用较雌激素强。由于人们害怕雌激素引起的乳腺癌和子宫内膜癌等副作用，因此对于许多具有心血管疾病风险的绝经妇女来说，组织选择性更好的雷洛昔芬有望取代雌激素成为心血管疾病的长期防治用药。但是，关于雷洛昔芬对心血管系统的影响目前尚在探讨之中，在对血管内皮细胞（endothelial cells，ECs）和血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）的影响方面，雷洛昔芬的作用也尚未完全明了。此外，关于雷洛昔芬心血管作用的机制目前报道很少。目前已发现雌激素受体（estrogen receptor，ER）的两种亚型ERα和ERβ都存在于血管壁，雌激素发挥作用的经典途径是通过核受体激活雌激素反应元件（estrogen-response elements，ERE）发挥基因组效应。关于雷洛昔芬的心血管作用与ER的关系以及雷洛昔芬对不同ER亚型介导的ERE转录活性的影响等都是值得关注的重要机制。因而，本课题就SERM类药物雷洛昔芬对心血管系统的作用及相关的分子机制进行系统的研究，主要包括以下4部分内容：（1）雷洛昔芬对大鼠血管平滑肌细胞增殖及细胞周期素D1（cyclinD1）基因表达的影响；（2）雷洛昔芬对大鼠血管平滑肌细胞囊泡素-1（caveolin-1）基因表达的影响及其与雌激素受体的关系；（3）雷洛昔芬对血管内皮素-1（endothelin-1，ET-1）基因表达的影响及与雌激素受体的关系；（4）雷洛昔芬对血管内皮细胞雌激素反应元件转录活性的影响及与雌激素受体亚型的关系第一部分雷洛昔芬对大鼠血管平滑肌细胞增殖及cyclinD1基因表达的影响目的：观察雷洛昔芬对原代培养的大鼠主动脉VSMCs增殖和凋亡的影响，并检测cyclinD1 mRNA和蛋白表达的变化。方法：1．原代培养大鼠主动脉平滑肌细胞，传至4～10代用于实验。2．采用MTT法和台盼蓝活细胞直接计数法测定不同浓度的雷洛昔芬和ICI182，780对原代培养的大鼠主动脉VSMCs增殖的影响。3．采用SP法观察10^-8mol／L雷洛昔芬对VSMCs增殖性细胞核抗原（PCNA）的影响。4．采用流式细胞仪观察10^-8mol／L雷洛昔芬对VSMCs细胞增殖周期的影响。5．采用RT-PCR和Western Blot方法分别检测雷洛昔芬处理后大鼠主动脉平滑肌细胞cyclinD1基因mRNA及蛋白表达水平的变化情况。6．构建cyclinD1基因启动子荧光素酶表达系统，转染VSMCs，观察雷洛昔芬对cyclinD1启动子转录活性的影响。结果：1．MTT法检测显示VSMCs经10^-8mol／L雷洛昔芬处理后增殖活性下降，抑制率约为26％，完全性雌激素受体阻断剂ICI182，780消除了雷洛昔芬的抑制效应，并在高浓度(10^-5 mol／L)时显著促进VSMCs增殖。台盼蓝活细胞直接计数法显示经10^-8mol／L雷洛昔芬处理后VSMCs细胞数较对照组减少约30％。2．10^-8mol／L的雷洛昔芬降低了VSMCs中PCNA的蛋白水平。3．流式细胞仪结果显示10^-8mol／L雷洛昔芬能阻滞细胞周期从G1期进入S期，G1期所占比例由69.0％增加为79.1％，S期所占比例由19.8％降为10.2％，并可见较小的凋亡峰。4．经10^-8mol／L雷洛昔芬处理后VSMCs的cyclinD1基因mRNA和蛋白水平均显著下降。5．经10^-8mol／L雷洛昔芬处理后VSMCs的cyclinD1基因启动子荧光素酶比活性显著下降。结论：雷洛昔芬可抑制血管平滑肌细胞cyclinD1启动子转录活性，抑制cyclinD1基因mRNA和蛋白水平表达，使VSMCs的细胞周期阻滞于G1期，从而抑制VSMCs增殖。第二部分雷洛昔芬对大鼠血管平滑肌细胞囊泡素-1基因表达的影响及其与雌激素受体的关系目的：观察雷洛昔芬对原代培养的大鼠主动脉VSMCs囊泡素-1 mRNA和蛋白表达的影响，探讨其与雌激素受体途径的关系。方法：1．采用不同浓度的雷洛昔芬(10^-8mol／L、10^-7mol／L、10^-6mol／L)处理培养的大鼠主动脉平滑肌细胞。2．采用RT-PCR和Western Blot方法检测雷洛昔芬作用不同时间段后（12h，24h）细胞囊泡素-1基因mRNA及蛋白表达的变化。3．加入完全性雌激素受体阻断剂ICI182，780，采用RT-PCR和Western Blot方法检测雷洛昔芬对VSMCs囊泡素-1基因mRNA及蛋白表达的影响。结果：1．不同浓度雷洛昔芬处理12h后细胞囊泡素-1基因mRNA及蛋白表达无明显变化，但24h后平滑肌细胞囊泡素-1基因mRNA及蛋白表达均明显增强。2．雷洛昔芬的这种增强作用可被完全性雌激素受体阻断剂ICI182，780所逆转。结论：本研究首次发现雷洛昔芬经雌激素受体途径增强血管平滑肌细胞囊泡素-1基因转录与翻译，在mRNA水平和蛋白水平增加囊泡素-1的表达，提示雷洛昔芬可通过作用于细胞生物信号转导蛋白影响细胞的增殖。第三部分雷洛昔芬对血管内皮细胞内皮素-1基因表达的影响及与雌激素受体的关系目的：观察选择性雌激素受体调节剂雷洛昔芬对血管内皮细胞内皮素-1基因表达的影响，并探讨雷洛昔芬的作用是否通过雌激素受体机制介导。方法：1．原代培养的牛颈动脉内皮细胞，采用10^-8mol／L雷洛昔芬处理培养的牛颈动脉内皮细胞24小时。2．提取细胞总RNA，取20ug进行Northern blotting分析，观察雷洛昔芬对血管内皮细胞内皮素-1mRNA表达的影响。3．同时合用雌激素受体阻断剂ICI182，780(10^-7mol／L)处理细胞，通过Northern blotting法观察10^-8mol／L雷洛昔芬对内皮素-1基因表达影响的变化。结果：1．与未经雷洛昔芬处理的细胞相比，10^-8mol／L雷洛昔芬处理后的血管内皮细胞内皮素-1 mRNA表达明显降低。2．若同时应用ICI182，780处理则雷洛昔芬的作用被阻断。结论：本研究发现选择性雌激素受体调节剂雷洛昔芬通过雌激素受体机制抑制血管内皮细胞内皮素-1基因表达，对血管内皮功能具有保护作用。第四部分雷洛昔芬对血管内皮细胞雌激素反应元件转录活性的影响及其与雌激素受体亚型的关系目的：观察雷洛昔芬对原代培养的牛颈动脉内皮细胞雌激素反应元件（ERE）转录活性的影响及其与雌激素受体亚型（ERα、ERβ）的关系。方法：1．采用真核细胞转染技术将ERE荧光素酶报告基因质粒ERE-TK-Luc与内参照质粒PRL-SV40共同转染培养的血管内皮细胞，分别给予不同浓度的雷洛昔芬(10^-9mol／L、10^-8mol／L、10^-7mol／L)与17-β雌二醇(10^-9mol／L)处理24小时。2．构建ERα、ERβ腺病毒载体系统，将ERα、ERβ导入培养的血管内皮细胞，然后转入ERE荧光素酶报告基因质粒ERE-TK-Luc与内参照质粒PRL-SV40，采用雷洛昔芬(10^-8mol／L)与17-β雌二醇(10^-9mol／L)分别处理24小时。3．双荧光素酶报告法检测经过不同处理的转染细胞荧光素酶的相对活性，并进行统计学比较。结果：1．10^-9mol／L的雷洛昔芬处理后细胞荧光素酶活性略降低，但与对照组比较，差异未达显著性，10^-8mol／L与10^-7mol／L的雷洛昔芬处理均使细胞荧光素酶活性明显降低，但后二者之间差异无显著性。作为比较，10^-9mol／L 17-β雌二醇处理后细胞荧光素酶活性显著升高（P＜0.001）。2．导入ERα的血管内皮细胞，10^-8mol／L的雷洛昔芬处理后荧光素酶活性显著低于未接受雷洛昔芬处理的细胞（P＜0.001），但10^-9mol／L17-β雌二醇处理后细胞荧光素酶活性无显著变化（P＞0.05）。3．导入ERβ的血管内皮细胞，10^-8mol／L的雷洛昔芬刺激后荧光素酶活性与未接受雷洛昔芬处理的细胞相比无明显变化（P＞0.05），但10^-9mol／L 17-β雌二醇处理后细胞荧光素酶活性显著升高（P＜0.001）。结论：1．在血管内皮细胞中，雌激素ERE作用途径雷洛昔芬降低ERE转录活性，主要是降低ERα介导的ERE转录活性，是一个ERα拮抗剂。2．在血管内皮细胞，雌激素主要升高ERβ介导的ERE转录活性，雷洛昔芬对此无明显影响，提示ERβ是介导血管内皮细胞雌激素作用的主要受体，而雷洛昔芬对ERβ无拮抗作用。3．雷洛昔芬可能通过ERE以外途径调节血管内皮细胞功能。本研究的局限性及不足之处（1）鉴于时间和经费等原因，本研究仅检测了雷洛昔芬处理后血管内皮细胞ET-1的mRNA表达，未能检测雷洛昔芬处理后血管内皮细胞ET-1的多肽表达水平。（2）本研究仅发现雷洛昔芬对血管内皮细胞的作用不是通过激活ERE途径，至于是否通过激活其它途径起作用，比如雷洛昔芬反应元件（raloxifene response element，RRE）途径或AP-1途径等，因为时间和经费等原因，本研究未能证实，有待进一步研究。