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肿瘤是威胁人类健康最严重的疾病之一,全世界每天约有2万人死于肿瘤。目前,肿瘤的发生机制尚不清楚,也没有针对肿瘤的特效治疗。肿瘤是多因素疾病,不仅与多种遗传基因相关,还与各种环境因素相关。Yusuf A Hannun于2016年在《nature》发表论文表明遗传因素在肿瘤发生中只起到10-30%的作用,而环境因素对肿瘤的发生影响更大,环境因素通过影响细胞周期、调节细胞自噬、干扰正常细胞凋亡、抑制细胞免疫等因素影响肿瘤发生。自噬是真核生物特有的一种的生命现象,在维持细胞内稳态,促进细胞生存方面起重要作用,广泛参与各种病理生理过程。近些年来,自噬与肿瘤的关系受到广泛关注,人们期待通过调控自噬干预肿瘤的发病进程,甚至希望通过调控自噬来彻底治愈肿瘤。肿瘤是慢性的疾病过程,在肿瘤发生不同阶段自噬可能起到不同甚至完全相反的作用。在肿瘤发生的起始阶段,自噬通过改善细胞微环境抑制肿瘤发生;然而肿瘤进展阶段,自噬可能起到保护肿瘤细胞耐受代谢应激,促进了肿瘤发展、播散及转移。但是,自噬对肿瘤的影响是直接作用还是间接作用,调控自噬能否改善肿瘤预后以及如何调控肿瘤自噬问题亟待进一步研究。钒是人体必需微量元素,具有多种生物学活性。在1987年Cantley发现钒酸根对ATP酶具有抑制作用,继而科学家又发现钒酸盐具有类胰岛素样作用,近年来又发现钒化合物的抗炎作用、杀精作用。1,10邻二氮杂菲双过氧钒酸钾(BPV(phen))一种稳定的过氧钒酸盐,具有广泛的生物学活性,Lada Rumora研究表明BPV(phen)能有诱导胰岛细胞系RIN-m5F凋亡。Chandler L.Walker研究表明BPV(phen)可能通过抑制调节细胞自噬够缓解颈髓损伤。但是BPV(phen)是否具有抗癌活性,是否调节肿瘤细胞自噬,以及如何调节细胞自噬机制十分不清。本研究拟探讨BPV(phen)对细胞自噬影响机制,以期为钒化合物用于肿瘤治疗提供理论基础。全部研究内容分为以下四部分:1.BPV(phen)抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡和细胞焦亡。探讨BPV(phen)对Hep G2、He LA以及MEF细胞增殖和凋亡的影响。MTT试剂盒检测BPV(phen)对细胞活力影响,观察BPV(phen)对细胞形态学的影响,Western Blotting检测细胞增殖和凋亡相关蛋白,流式细胞技术检测细胞凋亡。MTT实验结果发现BPV(phen)抑制细胞增殖,LDH活性实验发现BPV(phen)诱导细胞释放LDH,形态学发现BPV(phen)诱导细胞形态逐渐变圆,随着剂量增大细胞数目减少、部分细胞形态改变;Western Blotting检测结果发现PARP断裂带随剂量依赖性增加,PCNA变化不明显;Caspase1(对细胞焦亡的形成起决定作用,是细胞焦亡最重要的标志蛋白)呈现剂量依赖性增加。流式细胞学凋亡检测结果发现BPV(phen)10μM D2象限细胞明显增加,凋亡明显。以上实验结果提示BPV(phen)抑制细胞增殖,促进细胞凋亡和细胞焦亡。2.BPV(phen)对细胞自噬的影响。鉴于细胞凋亡、细胞焦亡与细胞自噬的密切关系,本研究探讨BPV(phen)对细胞自噬的影响。雌性C57BL/6小鼠适应性饲养1周后,随机分为两组,实验组给予皮下注射BPV(phen)2.5μmol/30 g每天一次×14 d,对照组注射生理盐水,第15天处死小鼠,取肝脏组织,Western Blotting检测细胞自噬标志性蛋白LC3。结果发现BPV(phen)腹腔注射小鼠肝脏组织LC3-Ⅱ表达水平明显升高,提示自噬启动被激活或者自噬体降解受到抑制。进一步通过引入自噬体降解抑制剂来阐明BPV(phen)是促进自噬启动还是抑制自噬体降解。取6孔板培养He La细胞,分为CTRL和BAF组,每组设BPV0、BPV2.5、BPV5、BPV10、BPV20亚组,待细胞生长状态良好,各组分别加入BPV(phen)或DMSO至BPV(phen)药物终浓度分别为0、2.5、5、10、20μM,继续培养48 h,在终止细胞培养前12 h,CTRL和BAF组分别加入DMSO或者BAF2μl。收集细胞用Western Blotting实验检测LC3蛋白。在Hep G2、MEF细胞重复以上实验。Western Blotting结果发现BPV(phen)剂量依赖性增加LC3-Ⅱ的表达,在加入抑制剂后LC3-Ⅱ不随BPV(phen)变化,在Hep G2、He LA以及MEF细胞系表现相同。在RFP-LC3细胞免疫荧光实验,观察10μM BPV(phen)在加入或不加入BAF两种情况下对RFP-LC3表达的影响。通过共聚焦显微镜技术可以观察到BPV(phen)10M明显增加RFP-LC3红色荧光颗粒数目,加入自噬体降解抑制剂BAF后,BPV(phen)组和CTRL组无明显差别。以上实验提示,BPV(phen)不是促进自噬的启动导致自噬体的增多,而是抑制了自噬体的降解而导致自噬体的增多。因此,本研究提示BPV(phen)抑制自噬体的降解。3.BPV(phen)降低P62蛋白水平及其机制。本研究在观察BPV(phen)对细胞自噬影响时,除了检测细胞自噬最重要的标志蛋白LC3之外,同时检测了另一个重要的自噬相关蛋白P62,结果发现BPV(phen)剂量依赖性降低P62蛋白水平。通常情况下抑制自噬体的降解将会抑制蛋白质通过自噬途径的降解,表现为P62蛋白水平升高。而本研究发现BPV(phen)抑制自噬但是P62却明显降低,因此BPV(phen)可能是通过其他途径影响P62蛋白水平。为阐明其机制,He LA细胞系加入蛋白生成抑制剂CHX后进行细胞培养,分为BPV(phen)组和CTRL组,观察在抑制蛋白质合成情况下BPV(phen)对P62水平的影响。结果发现在抑制蛋白质生成的情况下BPV(phen)降低P62蛋白水平,提示BPV(phen)促进P62的降解。为探明BPV(phen)对P62蛋白水平影响是通过自噬途径还是蛋白酶体途径,在He LA细胞系比较在加入自噬抑制剂BAF或和蛋白酶体降解抑制剂MG132情况下BPV(phen)对P62蛋白水平的影响,通过Western Blotting方法检测P62蛋白水平。结果发现MG132几乎逆转BPV(phen)对P62的降低作用,而应用BAF组仅部分逆转BPV(phen)对P62的降低作用。此外,取稳定表达RFP-LC3的He La细胞系分为三组,加入BPV(phen)培养,实验第48小时收集载玻片对P62进行免疫荧光染色,免疫荧光结果发现P62与RFP-LC3共定位在BAF应用后出现,而在MG132条件下P62和RFP-LC3没有共定位。BPV(phen)可能干扰P62和RFP-LC3亲和性。为检测BPV(phen)对P62泛素化水平的影响,在293T细胞过表达P62和Poly-ubiquitin,用Western Blotting检测分别在有和没有MG132情况下观察BPV(phen)对P62和泛素化蛋白的影响。在BPV(phen)作用下表现为非特异性Poly-ubiquitin水平升高。免疫共沉淀实验发现,在BPV(phen)作用下泛素化的P62水平增加。本研究提示,BPV(phen)通过增加了P62泛素化水平,促进其通过蛋白酶体途径降解,从而降低P62蛋白水平。4.BPV(phen)抑制自噬分子机制。为阐明BPV(phen)抑制自噬体降解具体分子机制。通常情况下,自噬体形成后需要通过乙酰化的微管被运送到溶酶体形成自噬溶酶体最终行使物质降解功能,BPV(phen)影响P62稳定性与抑制自噬体降解之间可能有某种联系。在HeLA细胞系沉默P62基因表达,检测其对对自噬体降解的影响及微管蛋白α-Tubulin乙酰化水平的影响。Western Blotting和免疫荧光检测结果发现,P62沉默抑制自噬体的降解,同时α-Tubulin乙酰化水平降低。而在He LA细胞系过表达P62基因,检测自噬体降解以及α-Tubulin水平,结果与沉默实验相一致。在He LA细胞系,Western Blotting检测BPV(phen)对微管蛋白α-Tubulin乙酰化水平的变化以及HDAC6蛋白水平的变化。通过免疫共沉淀实验,检测P62蛋白水平降低对HDAC6蛋白水平的影响。沉默内源性P62和过表达外源性P62,可以分别抑制和促进自噬体降解。BPV(phen)导致HDAC6与P62相互作用减弱,释放HDAC6。BPV(phen)通过P62-HDAC6通路抑制自噬体降解。综上所述,本研究发现BPV(phen)抑制细胞增殖、促进细胞凋亡和细胞焦亡,同时抑制自噬体降解。其影响自噬体降解的分子通路可能是,BPV(phen)促进P62蛋白酶体降解,后者增强HDAC6活性,继而HDAC6对乙酰化微管蛋白的去乙酰化作用增加,影响自噬体的转运。