【摘 要】
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背景和目的:中国食管癌年新发病例达20余万例,其中90%以上为食管鳞状细胞癌（Esophageal Squamous Cell Carcinoma,ESCC）,5年生存率仅有20.9%-30.3%,目前一线治疗模式仍以手术结合放化疗为主,尚无有效靶向药物。P21蛋白激活激酶4（p21-activated kinase 4,PAK4）是一种丝氨酸/苏氨酸激酶,泛癌种发挥癌基因作用,其小分子抑制剂已进
【基金项目】
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上海市科学技术委员会2016年度医学引导类（西医）科技支撑项目（16411966100）； 上海市卫生计生系统优秀学科带头人培养计划（2017BR055）； 国家自然科学基金（基金编号:81272608,81871882）；
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背景和目的:中国食管癌年新发病例达20余万例,其中90%以上为食管鳞状细胞癌（Esophageal Squamous Cell Carcinoma,ESCC）,5年生存率仅有20.9%-30.3%,目前一线治疗模式仍以手术结合放化疗为主,尚无有效靶向药物。P21蛋白激活激酶4（p21-activated kinase 4,PAK4）是一种丝氨酸/苏氨酸激酶,泛癌种发挥癌基因作用,其小分子抑制剂已进入临床I期研究,研究PAK4及其它小分子抑制剂在ESCC中作用,将为PAK4等小分子抑制剂靶向治疗食管鳞状细胞癌提供理论基础。研究方法:我们采用了免疫组化、免疫荧光和免疫印迹技术检测了食管鳞癌组织和ESCC细胞系中PAK4表达水平和CD8+T细胞数量,并分析了PAK4与患者临床病理特征以及CD8+T细胞数量的相关性;进一步采用慢病毒转染构建了过表达和沉默PAK4细胞系（KYSE30和KYSE150）,用实时细胞分析技术、划痕愈合实验和克隆形成实验,检测了PAK4表达水平对细胞恶性行为能力的影响;我们引入PF-03758309这一PAK4经典小分子抑制剂,用流式细胞检测计数、实时细胞分析分析技术、克隆形成实验和免疫印迹,研究了PF-03758309对食管鳞癌细胞的作用;然后我们采用了RNA-Seq、CO-IP、银染、质谱分析和免疫印迹技术,对PAK4在ESCC中发挥作用的机制进行了初步探索。最后我们在TE-1、KYSE30、KYSE150和KYSE510细胞系中,对靶向细胞周期的121个小分子化合物（细胞周期化合物库）进行了筛选。研究结果:在201例ESCC患者中,我们发现PAK4高表达与更高的T分期（T1 vs T2-T4,p＜0.001）,淋巴结转移（N0 vs N1-N3,p=0.001）和更高的TNM分期（I vs II-IV,p＜0.001）相关;Cox多因素分析表明PAK4过表达是ESCC患者术后死亡风险提高的独立危险因素,术后死亡风险HR=3.11（95%CI=2.02-4.77,P＜0.001）;在18例ESCC患者中发现PAK4表达水平与CD8+T细胞数量之间无相关性。KYSE30和KYSE150细胞系过表达PAK4后促进细胞增殖、迁移、划痕愈合和克隆形成,反之亦然;PF-03758309可明显抑制KYSE30和KYSE150细胞增殖和克隆形成,并诱导细胞凋亡。4对KYSE30-Con与KYSE30-PAK4细胞进行了转录组测序,KEGG信号通路基因富集分析,提示两组基因表达在凋亡,wnt信号,糖代谢和缺氧等相关分子通路上存在一定差异;PAK4过表达可保护KYSE30和KYSE150食管鳞癌细胞延迟凋亡;过表达PAK4可上调cyclin D1的表达,反之亦然。在KYSE150细胞系中,我们发现过表达PAK4后PD-L1表达上调,而在KYSE30细胞中未发现此现象。细胞周期化合物库筛选发现PLK4（Polo-like kinase 4）抑制剂CFI-400945是潜在有效抑制ESCC细胞增殖小分子化合物。研究结论:PAK4高表达是ESCC患者预后不良的独立危险因素;PAK4和PLK4可能是ESCC潜在治疗靶点;PAK4促增殖作用可能是由于上调cyclin D1表达引起的。
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