粘附类G蛋白偶联受体(Adhesion GPCRs)是仅在最近才被研究关注较多的一类GPCR结构。由于粘附类G蛋白偶联受体具有复杂的结构,其在生物体内的功能研究较少。此外,大多数粘附类G蛋白偶联受体仍是孤儿受体,没有明确已知的的配体,所以,粘附类G蛋白偶联受体的功能、信号转导研究和配体发现具有重要的意义。目前,据有关文献报道数据统计,全球范围内大约15%的夫妇受到不孕症的困扰,其中男性因素占50%以上,男性不育越来越成为大家关注的问题。粘附类GPR64(又称Adgrg2或HE6)主要在附睾组织表达,对男性生育起着重要的功能,这一重要功能引起了我们对这种受体的极大兴趣,因为它是男性生育能力提高或男性避孕的潜在目标。在小鼠的研究中GPR64可以导致睾丸积水,导致精子在输出小管中积聚,但是具体诱因却不清楚。最近,人类已知的内源性GPR64突变是人类阻塞性无精子症的原因之一,但是其信号转导途径并不清楚。此外,目前GPR64是孤儿受体,没有配体,目前已知的仅有Stachel序列衍生的激动肽,但是其活性并不是太好,不能为其功能研究提供有效的工具。因此,本文主要探究GPR64在生殖系统中的功能、信号转导、激动肽配体优化以及其与GPR64受体的结合模式。一、研究目的1:GPR64是否在生殖系统中发挥重要的功能。2:GPR64是通过那些下游目标蛋白调节输出小管水分重吸收功能。3:与人类疾病相关的已知GPR64内源性突变K990E对于下游G蛋白调控的影响。4:GPR64已知的Stachel序列衍生的激动肽配体优化以及该配体与GPR64受体结合模式研究。二、主要方法论文采用实时定量PCR(Real-time PCR)技术检测31个粘附类GPCRs(adhesion GPCRs)在附睾中的表达情况;应用实时定量PCR(Real-time PCR)技术检测输出小管与GPR64-promoter腺病毒标记输出小管单细胞中与水分调节相关的重要离子通道及Gs、Gq蛋白的表达情况;选用普通PCR、cDNA测序技术在基因层面检测GPR64移码突变敲除鼠构建是否成功;采用western blot等实验方法验证GPR64在附睾和HEK-293细胞系中的表达情况;应用HE染色技术检测WT鼠与GPR64-/Y敲除鼠在附睾和输出小管中精子淤积情况;使用GPR64-promoter腺病毒标记输出小管单细胞用于后期实验;用各种离子通道的抑制剂,研究在输出小管中水分重新收中重要的离子通道;利用免疫荧光染色技术检测了 GPR64、CFTR、Gs、Gq在附睾或者输出小管中表达位置;采用氯离子MQAE探针检测了WT鼠与GPR64-/Y敲除鼠输出小管结扎后细胞内Cl-浓度;应用氢离子BCECF-AM探针检测了WT鼠与GPR64-/Y敲除鼠输出小管结扎后细胞内pH值;采用膜片钳方式记录GPR64-promoter腺病毒标记输出小管单细胞及其HEK-293细胞重组系统中全细胞电流;使用Quick change的方法构建了GPR64已知的人类内源性疾病突变质粒K990E及其他GPR64相关的突变质粒;采用GloSensor cAMP技术在HEK-293细胞中检测GPR64对于Gs信号通路激活情况;采用NFAT-Luciferase双荧光素酶检测系统检测在HEK-293细胞中GPR64对于Gq信号通路激活情况;利用膜受体ELISA方法检测GPR64不同突变体的表达情况;使用丙氨酸扫描技术检测GPR64激动肽关键的氨基酸位点;应用改良的Bret方法检测GPR64不同突变体对其Stachel序列衍生的优化激动肽[FITC]V13FMe结合情况。三、主要结果1.在正常情况下和脂多糖(LPS)诱导附睾炎症情况下GPR64均表达较高通过Real-time PCR技术分析了31个adhesion GPCRs在附睾中的表达情况,发现大部分adhesion GPCRs在附睾中大量表达,其中,我们发现表达较高的3种adhesion GPCRs包括CD87、CELSR1和GPR64;同时在LPS造模诱导附睾炎症情况下,上述3种表达较高的adhesion GPCRs中只有GPR64大量表达。根据本文研究结果和已知的GPR64功能相关文献总结共同说明GPR64生殖系统中具有重要功能。2.GPR64移码突变敲除鼠的构建是成功的采用CRISPR-cas9技术在GPR64第1个外显子区域删去2bp后加入10bp核苷酸,导致移码突变。GPR64的翻译在信号肽区域停止,并且所有剪接变体均适合。通过普通的PCR及基因组DNA测序在基因层面共同验证了GPR64移码突变敲除鼠的构建是成功的,但基因水平有时并不代表蛋白水平的变化。我们后面检测了GPR64敲除鼠蛋白表达情况,GPR64在细胞膜表达,通过分离附睾头部膜蛋白检测在敲除鼠和WT鼠中的GPR64表达情况,最终验证GPR64敲除鼠的构建是成功的。3.GPR64敲除鼠生育能力降低并伴随输出小管精子淤积通过统计WT与GPR64-/Y敲除鼠胚胎数目,结果表明GPR64敲除后生育能力降低;通过统计WT与GPR64-/Y敲除鼠附睾尾部精子数目检测和附睾HE染色并进行精子面积统计发现GPR64-/Y敲除鼠在附睾中的精子数目减少;通过WT与GPR64-/Y敲除鼠输出小管的HE染色并统计精子面积发现GPR64-/Y敲除鼠精子在输出小管大量淤积。4.GPR64敲除后影响睾丸水分重吸收功能通过检测WT与GPR64-/Y敲除鼠正常情况下睾丸的重量发现GPR64-Y睾丸的重量明显比WT的重,预示GPR64可能在水分重新收中起到重要的功能,另外我们通过附睾头部结扎实验,发现附睾头部结扎后导致GPR64-Y睾丸水分增加明显,共同说明了GPR64在睾丸水分重吸收中起到重要的功能。5.GPR64敲除鼠并未影响附睾发育,但影响输出小管水分重吸收功能由于GPR64在附睾头部表达,我们猜测是否GPR64敲除鼠的附睾发育受到影响从而影响水分重吸收,结果表明GPR64敲除后并未影响附睾的发育。另外由于睾丸中80%水分经由输出小管重新吸收,我们分离输出小管,测定正常情况下输出小管宽度,结果其宽度并未发生变化,GPR64并未影响正常情况下输出小管宽度。我们参照文献,采用输出小管两端结扎的方式,观察不同结扎时间点输出小管宽度的变化。结果表明:随着结扎时间的延长GPR64敲除鼠输出小管鼓胀明显,表明GPR64在输出小管水分重吸收中起到重要的功能。6.GPR64敲除鼠输出小管水分重吸收功能障碍可能与CFTR离子通道调控相关我们选取了输出小管重要的离子调节通道例如CFTR(囊性纤维性变转移酶传导调节蛋白)、Anoctamin-1(ANO1)、钠-氢反向转运蛋白1(NHE1)、钠-氢反向转运蛋白3(NHE3)、碳酸酐酶ⅡI(CAⅡ)、腺瘤下调蛋白(DRA)、溶质载体家族26成员9(SLC26A9)、氯离子通道配件1(CLCA1)等,通过Real-time PCR筛选了输出小管及GPR64-promoter标记的细胞相对表达较高的离子通道CFTR、ANO1、NHE1、DRA、NKCC、SLC26a9、CAⅡ,对正常输出小管结扎后采用上述通道的抑制剂,观察输出小管在各个抑制剂作用下不同时间点的鼓胀情况,结果表明:采用CFTR抑制剂CFTRinh-172可以模拟GPR64敲除鼠的表型,说明GPR64敲除鼠输出小管水分重吸收功能障碍可能与CFTR离子通道调控相关。7.GPR64敲除后影响CFTR离子通道功能为了研究GPR64敲除鼠输出小管水分重吸收功能障碍是否与CFTR离子通道调控相关,首先我们采用免疫荧光技术证实GPR64与CFTR表达位置相同,均表达在输出小管非纤毛细胞,我们测定了 WT鼠与GPR64-/Y敲除鼠输出小管结扎48h后的氯离子浓度和pH值,发现GPR64-/Y敲除鼠氯离子浓度较高和pH值较高,氯离子和氢离子稳态失衡;通过全细胞电流实验进一步证实,GPR64-/Y敲除鼠影响CFTR调控的氯离子电流,但是GPR64敲除后并未影响CFTR的表达。总之,GPR64敲除会影响CFTR离子通道的功能,但是并未影响其表达。8.GPR64调控CFTR的功能与下游Gq蛋白相关,并且β-arrestin1在GPR64与CFTR复合物的形成中起着重要的作用本论文通过检测了下游G蛋白在输出小管中的表达情况,发现Gq与GPR64表达在相同的细胞,即非纤毛细胞;并进一步通过验证Gq+/-敲除鼠输出小管结扎48h后其细胞中氯离子和氢离子浓度,发现Gq蛋白在敲除后细胞氯离子浓度和pH值偏高,间接反应Gq蛋白影响CFTR功能(我们在elife文章中验证了Gq+/-敲除鼠的电流,并且在正常GPR64-promoter标记的原代细胞采用Gs和Gq的抑制剂均证实Gq蛋白在介导GPR64调控CFTR的功能中起着重要的作用(该部分工作我均有参与,前面合作者张道来毕业论文已用该部分数据,所以该部分数据未在毕业论文中体现);后期实验通过检测证β-arrestin1-/-和β-arrestin2-/-敲除鼠输出小管结扎48h后组织细胞中氯离子和氢离子浓度,发现β-arrestin1敲除鼠氯离子和pH值偏高,β-arrestin1蛋白影响CFTR的功能。(同时我们在elife文章中通过体内输出小管和体外293细胞系系统,采用CO-IP实验验证了GPR64与CFTR蛋白可以形成复合物,并且β-arrestin1在复合物形成中起着促进作用,免疫荧光的结果证实β-arrestin1敲除后,影响CFTR与GPR64的共定位(该部分工作我均有参与,前面合作者张毕业论文已用该部分数据,所以该部分数据未在毕业论文中体现)。9.HEK-293细胞系证实GPR64可以组成性激活Gs、Gq通路信号在HEK-293细胞中采用GloSensor cAMP检测技术检测到GPR64FL与GPR64beta可以组成性激活内源性cAMP水平,表明GPR64可以组成性激活Gs信号通路;在HEK-293细胞中采用NFAT-Luciferase双荧光素酶的报告系统检测到GPR64FL与GPR64beta可以激活NFAT的转录水平,表明GPR64可以组成性激活Gq信号通路。10.GPR64已知与人类生殖相关的疾病突变K990E可以降低Gs与Gq通路信号通过Quick change构建了GPR64与人类生殖疾病相关的GPR64FL-K990E、GPR64Beta-K990E突变质粒。采用GloSensor cAMP技术在HEK-293细胞中检测GPR64FL-K990E突变对于Gs信号通路影响,研究结果表明K990E突变可以降低GPR64的组成性激活内源性cAMP水平,降低Gs通路信号;在HEK-293细胞中采用NFAT-Luciferase双荧光素酶检测系统检测NFAT转录水平,表明GPR64FL-K990E可以降低GPR64的组成性激活NFAT转录水平,降低Gq通路信号。11.GPR64已知与人类生殖相关的疾病突变K990E导致GPR64调控CFTR通道电流降低在HEK-293细胞重组系统,采用全细胞膜片钳技术检测GPR64FL-K990E突变对CFTR电流的调控能力,结果表明GPR64FL-K990E突变对于CFTR电流的调节能力降低,CFTR电流下降。1 2.GPR64已知的Stachel序列衍生的多肽P15第1、3位对其活性较为关键通常用丙氨酸扫描技术将第一个到最后一个氨基酸依次突变为丙氨酸。通过实验发现,peptide p15的关键氨基酸为红色标记的TSFGILLDLSRTSLP,这些氨基酸的突变能够完全破坏peptide的激活GPR64的cAMP的作用。并且通过peptide p15两端氨基酸截短,发现两端的氨基酸对于p15的活力至关重要,并通过序列比对第1位,第3、5、6、7位是Adhesion GPCR中的较保守的氨基酸,采用不同氨基酸突变和非天然氨基酸修饰,结果表明第1位T变为输水氨基酸V和第3位F变为非天然氨基酸Phe(4Me)活性较好。13.GPR64已知的Stachel序列衍生的优化短肽V13FMe与p15相比对于GS、Gq、β-arrestin1、β-arrestin2信号转导增强GPR64已知的Stache1序列衍生的激动肽优化短肽V13FMe与p15相比对GPR64的激活效果更好,并使GPR64产生的Gs、Gq、、β-arrestin1和β-arrestin2信号通路激活更强,激活Gs信号通路半激活浓度约为471.5nmol/L,P15的半激活浓度约为81.4μmol/L,V13FMe半激活浓度是P15的172倍。同时与P15相比可以产生激活Gq、、β-arrestin1、β-arrestin2信号通路的现象,同时激活Gq的半激活浓度EC50约为214.5μmol/L,激活β-arrestin1信号通路的半激活浓度EC50约为20μmol/L,激活β-arrestin2信号通路的半激活浓度EC50约为30μmol/L。14.GPR64突变体W757A、1758A、V768A、F824A、F826A对GPR64已知的Stachel序列衍生的优化短肽V13FMe亲和力显著降低采用不同浓度(10-10、10-9、10-8、10-7、10-6、2×10-6、5×10-6、10-5mol/L)的异硫氰酸荧光素(FITC)标记的GPR64激活多肽V13FMe,采用改良Bret实验方法,研究其对GPR64不同突变体的结合能力,通过对其EC50结果分析表明其突变体W757A、I758A、V768A、F824A,F826A突变后,与其结合能力完全丧失,说明这五个氨基酸位点与GPR64结合[FITC]V13FMe短肽密切相关。15.GPR64不同突变体对于激活多肽V13FMe结合能力,影响下游cAMP水平采用GloSensor cAMP技术在HEK-293细胞中检测GPR64不同突变体对于下游Gs信号通路影响。结果表明:与WT(GPR64△-GPS-beta)相比,不同GPR64突变体对V13FMe结合能力下降,导致其下游cAMP激活水平降低,例如W757A、I758A、N759A、V762A、V768A、W824A、F826A。但是 V13FMe对于S760A、F772A、F828A、V836A、I844A、F845A结合能力没有发生明显变化,但是其cAMP水平降低,可能是结合下游Gs蛋白能力发生变化导致的。四、主要结论:1.GPR64在附睾组织和附睾炎症诱导下表达水平较高。2.GPR64移码突变敲除鼠构建是成功的。3.GPR64敲除后生育能力降低并伴随附睾精子数目降低而精子主要在输出小管淤积的现象。4.GPR64敲除后影响睾丸和输出小管水分重吸收功能。5.GPR64主要通过调控CFTR离子通道影响输出小管水分重吸收功能。6.GPR64主要通过调控Gq蛋白影响CFTR离子通道对输出小管水分重吸收功能。7.β-arrestin1蛋白在GPR64和CFTR复合物形成中起着重要作用。8.已知的GPR64与人类生殖相关的疾病突变K990E影响Gs与Gq信号通路。9.已知的GPR64与人类生殖相关的疾病突变K990E影响CFTR电流。10.GPR64已知的Stachel序列衍生的激动肽P15第1、3位对其提供其活性较为关键。11.GPR64已知的Stachel序列衍生的短肽V13FMe与p15相比对于GS、Gq、β-arrestin1、β-arrestin2信号转导增强。12.GPR64突变体W757A、1758A、V768A、F824A、F826A后对于GPR64激活多肽[FITC]V13FMe结合能力消失。13.GPR64不同突变体对于激活多肽V13FMe结合能力影响影响下游cAMP水平变化。