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逆转录病毒的包装和释放一直是逆转录病毒生活周期的研究热点。近年来,发现转运必需内吞体分选复合物(Endosomal Sorting Complex Required forTransport,ESCRT)在逆转录病毒复制周期的包装与出芽环节起到关键作用。Citron kinase是一种GTPase RhoA的效应物,我们以前的研究发现citron kinase可以促进HIV-1病毒的释放,但是具体作用机制尚不清楚。在本文中我们进一步探讨了citron kinase的作用机制以及可能影响它发挥功能的其它宿主蛋白。
通过免疫共沉淀实验,我们发现了citron kinase和HIV结构蛋白Gag之间有着相互作用,并且这种相互作用是依赖citron kinase第3,4个亮氨酸拉链和锌指结构域。通过免疫荧光实验和透射电子显微镜分析,我们发现了citronkinase可以改变HIV-1病毒的包装出芽位点,使之由在细胞膜上包装出芽的方式转变为主要在早期内体/多泡体的包装出芽方式,在此过程中,citron kinasc可以促进Gag蛋白的单泛素化,使之更好地进入多泡体途径以及募集下游ESCRT复合物。敲低一种HECT型泛素连接酶Nedd4L的表达,可以降低citronkinase对Gag泛素化的作用,同时削弱了citron kinase促进HIV-1病毒释放量的功能。提示着Nedd4L可能参与citron kinase促进HIV病毒包装释放的过程。
同时我们还发现了另外一个ESCRT复合物的组分,肝细胞生长因子调节酪氨酸激酶底物(hepatocyte growth factor-regulated tyrosine kinase substrate,Hrs)可以通过FYVE结构域与citron kinase作用,而过表达Hrs或者过表达Hrs单独的FYVE结构域都可以抑制HIV-1病毒的释放以及citron kinase促进病毒包装释放的功能。而不含FYVE的Hrs突变体抑制citron kinase促进病毒释放的功能则弱很多。敲低Hrs的表达可以提高HIV-1病毒产生量并且促进citronkinase的作用。说明Hrs通过FYVE结构域抑制citron kinase促进病毒释放的功能。
此外,我们还证明了citron kinase对于野生型HIV-1病毒包装释放是必须的,HIV感染可以引起citron kinase在PBMC细胞中表达的上调。