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目的:探讨转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)诱导近端肾小管上皮细胞(human renal proximal tubular epithelial cells,HK-2)转分化过程中,α-1,6岩藻糖基转移酶(α-1,6 fucosyl trans ferase,Fut8)催化核心岩藻糖基化修饰对肾小管上皮细胞自噬的影响。方法:(1)在大连医科大学附属第一医院2015年1月至2016年12月肾活检确诊为原发性IgA肾病的120例患者中,按Banff07肾间质纤维化程度分级方法,分成无纤维化、轻度、中度、重度四组,每组随机选取10例患者,共40例患者,利用电子显微镜计数肾小管上皮细胞中的自噬体个数,并对各组的平均视野下自噬体数量进行分析统计。(2)对四组患者的肾活检病理组织进行自噬相关蛋白beclin-1免疫组化染色,比较分析各组beclin-1的表达强度差异,进一步确定IgA肾病各组自噬活性的变化趋势。(3)免疫荧光双重染色:体外培养人的永生化HK-2细胞,并分为两组:正常对照组(CON组):10%血清的DMEM/F12培养液常规培养48h;TGF-β1刺激组(TGF组):向不含血清的DMEM/F12培养液中,加入终浓度为10ng/ml的TGF-β1刺激因子孵育细胞48h;对两组分别进行自噬相关蛋白beclin-1与肌成纤维细胞标记物α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)免疫荧光双重染色,并比较分析。(4)免疫印迹法检测:体外培养人的永生化HK-2细胞并分五组,CON组,用含10%血清的DMEM/F12培养液常规培养48h;Fut8-siRNA沉默组,即用siRNA-mate转染试剂将Fut8-siRNA瞬时转染进HK-2细胞,再用10%血清的DMEM/F12培养液常规培养48h;TGF-β1刺激组(TGF组),向不含血清的DMEM/F12培养液中加入终浓度为10ng/ml的TGF-β1刺激细胞48h;TGF-β1刺激+Fut8-siRNA沉默组(TGFF组),将Fut8-siRNA瞬时转染进HK-2细胞,抑制FUT8的表达,再加入终浓度为10ng/ml的TGF-β1孵育细胞48h;TGF-β1+Mock组(TGFM组),将对照的无序siRNA瞬时转染进HK-2细胞,再向不含血清的DMEM/F12培养液中加入终浓度为10ng/ml的TGF-β1刺激细胞48h;用免疫印迹技术检测各组α-SMA、FUT8和beclin-1的表达并进行统计分析。结果:(1)电镜下对IgA肾病各组观察,肾间质无纤维化组自噬体平均个数为0.880±0.161、轻度组自噬体平均个数为1.470±0.133、中度组自噬体平均个数为2.030±0.200、重度组自噬体平均个数为1.560±0.171,与无纤维化组相比,轻度、中度、重度组自噬体数量明显增加,且P<0.05,差异有统计学意义,其中中度组自噬体平均数量最多,重度组自噬体平均数量少于中度组。(2)IgA肾病各组通过免疫组化染色可见:在无纤维化组的10例患者中,beclin-1呈弱表达的例数占所在组70%;轻度组的10例患者中beclin-1有6例呈中等表达,占所在组例数的60%;中度组的10例患者beclin-1高表达例数占60%;重度组的10例患者中有5例中等表达,占总体的50%,高表达组有3例,占本组30%;与无纤维化组相比,轻度、中度、重度组beclin-1表达明显上调,其中中度组beclin-1高表达比例明显高于轻度、重度组。(3)为了检测肾小管上皮细胞转分化与自噬体之间的关系,我们通过免疫荧光双染的方法检测α-SM A与beclin-1的表达,结果显示:与CON组相比,TGF组中α-SMA荧光强度明显增加,而beclin-1荧光强度明显减弱,免疫荧光结果说明TGF-β1刺激肾小管上皮细胞对自噬具有抑制作用。(4)为了验证荧光结果及核心岩藻糖基化修饰与自噬体之间的关系,我们进行了免疫印记的半定量分析,其结果显示:在CON组中α-SMA蛋白呈低表达,beclin-1呈中等表达;Fut8-siRNA沉默组中α-SMA蛋白表达弱于CON组,而beclin-1蛋白表达明显增强(P<0.01);与CON组相比,TGF组中α-SMA蛋白表达增加(P<0.01),beclin-1表达减少(P<0.01);与TGF组相比,在TGFF组中α-SMA表达明显较少,而beclin-1表达明显增加;TGFM组中的α-SMA及beclin-1蛋白表达基本与TGF组相似,免疫印迹结果说明,FUT8催化的TGF-β受体核心岩藻糖基化对自噬具有抑制作用。结论:1.在肾间质纤维化各个阶段,肾小管上皮细胞中自噬体数量存在显著差异2.TGF-β1刺激肾小管上皮细胞转分化过程中,对自噬具有抑制作用。3.核心岩藻糖基化修饰对自噬具有抑制作用。