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目的:
间质性肺疾病(ILD)是一组主要累及肺间质与肺泡腔、表现为肺泡-毛细血管功能单位渐渐丧失的肺部弥漫性的实质性疾病，甚者可以发展为弥漫性肺纤维化及蜂窝肺，最终因呼吸衰竭而死亡。而特发性肺纤维化(IPF)属于间质性肺疾病中的一种常见疾病类型，具有极高的病死率。IPF是一种慢性、进行性、纤维化性的间质性肺炎，目前认为其起源于肺泡上皮细胞在反复发生微小损伤后的异常修复。大量的研究表明，上皮-间质转分化(EMT)在肺纤维化过程中普遍存在，是肺纤维化发生的重要机制[1-3]。本实验室的前期研究表明，表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)干预可以明显缓解博来霉素诱导的小鼠肺纤维化，下调EGFR/Akt信号通路活性，使得EMT间质标志物α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达减少，同时伴有叉头盒蛋白o3a(Foxo3a)的活化增加[4-6]，提示Foxo3a对小鼠肺纤维化起保护作用，但相关下游信号通路与具体的作用机制目前仍不清楚。因此本研究采用气管内滴入博来霉素(3mg/kg)的经典方法以建立C57BL/6小鼠肺纤维化模型，并给予EGFR-TKI代表药物之一的吉非替尼干预，探讨Foxo3a下游相关信号通路的变化，阐明Foxo3a在肺纤维化EMT中可能的作用机制，以寻找肺纤维化的关键药靶，争取为肺纤维化治疗进展提供新的思路。
方法:
1.EGFR/Foxo3a/Snail1通路在博来霉素致小鼠肺纤维化中的作用
将30只6周龄的SPF级C57BL/6小鼠随机地平均分成3个组（雌雄各半），每组10只:分别为对照组、博来霉素组、吉非替尼干预组。建模方法参考吉非替尼抑制博来霉素诱导的小鼠肺纤维化的实验研究[4]。将各组小鼠麻醉成功后固定于小鼠手术操作台，纵行切开颈前皮肤暴露气管，朝博来霉素组与吉非替尼干预组小鼠向心端气管内注入100μl博来霉素溶液(3mg/kg溶于100μl的0.9％的氯化钠注射液)，对照组小鼠注入等量的0.9％的氯化钠注射液。注射后旋即令小鼠头朝上且直立旋转以使药液在其肺内分布均匀;同时，连续14天给各组小鼠实施灌胃，吉非替尼干预组小鼠在气管内滴入博来霉素溶液后每日给予100μl吉非替尼溶液（20mg/kg溶于100μl的5％葡萄糖溶液）灌胃，对照组与博来霉素组小鼠则每日给予100μl的5％葡萄糖溶液灌胃，于造模之后的第14天处死小鼠，解剖并收集小鼠肺组织标本。将各组小鼠肺组织浸泡于4％多聚甲醛溶液中，固定48个小时后，将肺组织取出进行脱水、石蜡包埋、切片后，行苏木精-伊红(Hematoxylin-eosin，HE)染色与马松三色染色(Massons trichrome staining)，并分别参照Mikawa[7]法以及Ashcroft[8]法对肺组织进行炎症损伤程度评分和纤维化程度评分。另取各组小鼠肺组织则用玻璃匀浆器匀浆后分别进行总RNA及总蛋白的提取，反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测小鼠肺组织α-SMA、E-钙黏蛋白(E-Cadherin)、Foxo3a、叉头盒m1(Forkhead box m1，Foxm1)、Snail1的mRNA表达水平，蛋白印迹(Western Blot)法检测小鼠肺组织α-SMA、E-Cadherin、Foxm1、Snail1蛋白的表达水平、Foxo3a总蛋白水平以及Foxo3a磷酸化比例。
2.统计学方法
采用SPSS20.0对所有实验结果进行统计学处理。所有数据均进行正态性检验和方差齐性检验，符合正态性检验后以均数±标准差((x)±s)表示。若样本符合正态分布、方差齐，则多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，两两比较采用Bonferroni检验法，当P＜0.05时，即认为差异有统计学意义;若样本符合正态分布、但方差不齐，则多组间比较采用非参数检验法中的Kruskal-Wallis H检验，两两比较采用邓恩多重比较检验法，当P＜调整显著性水准时，即认为差异有统计学意义。
结果:
1.EGFR/Foxo3a/Snail1通路在博来霉素致小鼠肺纤维化中的作用
1.1 三组小鼠的肺组织炎症损伤程度评分
三组小鼠的肺组织炎症损伤程度评分的差异具有统计学意义(F=90.087，P=0.000)。对照组小鼠肺组织结构完整而清晰，肺泡壁薄且较连续，肺泡无明显的炎症细胞浸润;博来霉素组小鼠肺组织出现弥漫性实变，肺泡壁增厚明显，肺泡间隔破坏，肺泡中可见大量炎症细胞浸润，较多成纤维细胞出现在肺间质;吉非替尼干预组小鼠肺组织的炎症损伤程度处于对照组与博来霉素组之间。参照Mikawa[7]法进行肺组织炎症损伤评分。三组小鼠肺组织炎症损伤程度评分依次为(1.80±0.83)、(8.60±0.89)、(2.60±0.89)分，博来霉素组小鼠肺组织炎症损伤程度评分较对照组的升高（P＜0.01)，吉非替尼干预组小鼠肺组织炎症损伤程度评分较博来霉素组的下降（P＜0.01)，较对照组的升高（P=0.522）。
1.2 三组小鼠肺组织纤维化程度评分
三组小鼠肺组织纤维化程度评分的差异具有统计学意义(F=38.111，P=0.000)。对照组小鼠肺组织结构清晰，未见明显炎症细胞浸润及上皮下的蓝色胶原沉积;博来霉素组小鼠肺组织结构紊乱，肺间质可见炎症细胞浸润，上皮下的蓝色胶原沉积明显增加;吉非替尼干预组小鼠肺组织的肺泡壁稍增厚，有少量炎症细胞浸润，但结构基本完整，伴有少量蓝色胶原沉积。肺组织纤维化程度的评分参照Ashcroft[8]法。三组小鼠肺组织纤维化程度评分依次为(1.40±0.55)、(5.60±1.14)、(2.80±0.45)分，博来霉素组小鼠肺组织纤维化程度评分较对照组的升高（P＜0.01），吉非替尼干预组小鼠肺组织纤维化程度评分较博来霉素组的下降（P＜0.01)，较对照组的升高（P＜0.05)。
1.3 三组小鼠肺组织α-SMA mRNA表达水平
三组小鼠肺组织α-SMA mRNA表达水平的差异具有统计学意义（F=15.690，P=0.001）。博来霉素组小鼠肺组织α-SMA mRNA表达水平较对照组的升高(1.72±0.44比0.80±0.12，P＜0.01);吉非替尼干预组小鼠肺组织α-SMA mRNA表达水平较博来霉素组的降低(0.80±0.10比1.72±0.44，P＜0.01)，较对照组的降低(0.80±0.10比0.80±0.12，P=1.000)。
1.4 三组小鼠肺组织E-Cadherin mRNA表达水平
三组小鼠肺组织E-Cadherin mRNA表达水平的差异具有统计学意义（F=16.665，P=0.001）。博来霉素组小鼠肺组织E-Cadherin mRNA表达水平较对照组的降低(0.13±0.02比0.31±0.08，P＜0.01);吉非替尼干预组小鼠肺组织E-Cadherin mRNA表达水平较博来霉素组的升高（0.33±0.05比0.13±0.02，P＜0.01)，较对照组的升高(0.33±0.05比0.31±0.08,P=1.00)。
1.5 三组小鼠肺组织Foxo3a mRNA表达水平
三组小鼠肺组织Foxo3a mRNA表达水平的差异不具有统计学意义（F=0.575，P=0.582）。博来霉素组小鼠肺组织Foxo3a mRNA表达水平较对照组的降低(0.60±0.32比0.74±0.39，P=1.000);吉非替尼干预组小鼠肺组织Foxo3a mRNA表达水平较博来霉素组的升高（0.97±0.69比0.60±0.32，P=0.950），较对照组的升高(0.97±0.69比0.74±0.39,P=1.000)。
1.6 三组小鼠肺组织Foxm1mRNA表达水平
三组小鼠肺组织Foxm1mRNA表达水平的差异不具有统计学意义（F=0.648，P=0.546）。博来霉素组小鼠肺组织Foxm1mRNA表达水平较对照组的升高(0.22±0.16比0.13±0.09，P=1.000);吉非替尼干预组小鼠肺组织Foxm1mRNA表达水平较博来霉素组的升高(0.26±0.24比0.22±0.16，P=1.000)，较对照组的升高(0.26±0.24比0.13±0.09,P=0.887)。
1.7 三组小鼠肺组织Snail1mRNA表达水平
三组小鼠肺组织Snail1mRNA表达水平的差异具有统计学意义（F=33.487，P=0.000）。博来霉素组小鼠肺组织Snail1mRNA表达水平较对照组的升高(3.22±0.52比1.35±0.24，P＜0.01);吉非替尼干预组小鼠肺组织Snail1mRNA表达水平较博来霉素组的降低（1.15±0.38比3.22±0.52，P＜0.01），较对照组的降低(1.15±0.38比1.35±0.24，P=1.000)。
结论:
Foxo3a活性的增加可负调控Snail1，下调α-SMA表达、上调E-Cadherin表达，从而减轻博来霉素诱导的小鼠肺纤维化上皮-间质转分化。
间质性肺疾病(ILD)是一组主要累及肺间质与肺泡腔、表现为肺泡-毛细血管功能单位渐渐丧失的肺部弥漫性的实质性疾病，甚者可以发展为弥漫性肺纤维化及蜂窝肺，最终因呼吸衰竭而死亡。而特发性肺纤维化(IPF)属于间质性肺疾病中的一种常见疾病类型，具有极高的病死率。IPF是一种慢性、进行性、纤维化性的间质性肺炎，目前认为其起源于肺泡上皮细胞在反复发生微小损伤后的异常修复。大量的研究表明，上皮-间质转分化(EMT)在肺纤维化过程中普遍存在，是肺纤维化发生的重要机制[1-3]。本实验室的前期研究表明，表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)干预可以明显缓解博来霉素诱导的小鼠肺纤维化，下调EGFR/Akt信号通路活性，使得EMT间质标志物α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达减少，同时伴有叉头盒蛋白o3a(Foxo3a)的活化增加[4-6]，提示Foxo3a对小鼠肺纤维化起保护作用，但相关下游信号通路与具体的作用机制目前仍不清楚。因此本研究采用气管内滴入博来霉素(3mg/kg)的经典方法以建立C57BL/6小鼠肺纤维化模型，并给予EGFR-TKI代表药物之一的吉非替尼干预，探讨Foxo3a下游相关信号通路的变化，阐明Foxo3a在肺纤维化EMT中可能的作用机制，以寻找肺纤维化的关键药靶，争取为肺纤维化治疗进展提供新的思路。
方法:
1.EGFR/Foxo3a/Snail1通路在博来霉素致小鼠肺纤维化中的作用
将30只6周龄的SPF级C57BL/6小鼠随机地平均分成3个组（雌雄各半），每组10只:分别为对照组、博来霉素组、吉非替尼干预组。建模方法参考吉非替尼抑制博来霉素诱导的小鼠肺纤维化的实验研究[4]。将各组小鼠麻醉成功后固定于小鼠手术操作台，纵行切开颈前皮肤暴露气管，朝博来霉素组与吉非替尼干预组小鼠向心端气管内注入100μl博来霉素溶液(3mg/kg溶于100μl的0.9％的氯化钠注射液)，对照组小鼠注入等量的0.9％的氯化钠注射液。注射后旋即令小鼠头朝上且直立旋转以使药液在其肺内分布均匀;同时，连续14天给各组小鼠实施灌胃，吉非替尼干预组小鼠在气管内滴入博来霉素溶液后每日给予100μl吉非替尼溶液（20mg/kg溶于100μl的5％葡萄糖溶液）灌胃，对照组与博来霉素组小鼠则每日给予100μl的5％葡萄糖溶液灌胃，于造模之后的第14天处死小鼠，解剖并收集小鼠肺组织标本。将各组小鼠肺组织浸泡于4％多聚甲醛溶液中，固定48个小时后，将肺组织取出进行脱水、石蜡包埋、切片后，行苏木精-伊红(Hematoxylin-eosin，HE)染色与马松三色染色(Massons trichrome staining)，并分别参照Mikawa[7]法以及Ashcroft[8]法对肺组织进行炎症损伤程度评分和纤维化程度评分。另取各组小鼠肺组织则用玻璃匀浆器匀浆后分别进行总RNA及总蛋白的提取，反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测小鼠肺组织α-SMA、E-钙黏蛋白(E-Cadherin)、Foxo3a、叉头盒m1(Forkhead box m1，Foxm1)、Snail1的mRNA表达水平，蛋白印迹(Western Blot)法检测小鼠肺组织α-SMA、E-Cadherin、Foxm1、Snail1蛋白的表达水平、Foxo3a总蛋白水平以及Foxo3a磷酸化比例。
2.统计学方法
采用SPSS20.0对所有实验结果进行统计学处理。所有数据均进行正态性检验和方差齐性检验，符合正态性检验后以均数±标准差((x)±s)表示。若样本符合正态分布、方差齐，则多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，两两比较采用Bonferroni检验法，当P＜0.05时，即认为差异有统计学意义;若样本符合正态分布、但方差不齐，则多组间比较采用非参数检验法中的Kruskal-Wallis H检验，两两比较采用邓恩多重比较检验法，当P＜调整显著性水准时，即认为差异有统计学意义。
结果:
1.EGFR/Foxo3a/Snail1通路在博来霉素致小鼠肺纤维化中的作用
1.1 三组小鼠的肺组织炎症损伤程度评分
三组小鼠的肺组织炎症损伤程度评分的差异具有统计学意义(F=90.087，P=0.000)。对照组小鼠肺组织结构完整而清晰，肺泡壁薄且较连续，肺泡无明显的炎症细胞浸润;博来霉素组小鼠肺组织出现弥漫性实变，肺泡壁增厚明显，肺泡间隔破坏，肺泡中可见大量炎症细胞浸润，较多成纤维细胞出现在肺间质;吉非替尼干预组小鼠肺组织的炎症损伤程度处于对照组与博来霉素组之间。参照Mikawa[7]法进行肺组织炎症损伤评分。三组小鼠肺组织炎症损伤程度评分依次为(1.80±0.83)、(8.60±0.89)、(2.60±0.89)分，博来霉素组小鼠肺组织炎症损伤程度评分较对照组的升高（P＜0.01)，吉非替尼干预组小鼠肺组织炎症损伤程度评分较博来霉素组的下降（P＜0.01)，较对照组的升高（P=0.522）。
1.2 三组小鼠肺组织纤维化程度评分
三组小鼠肺组织纤维化程度评分的差异具有统计学意义(F=38.111，P=0.000)。对照组小鼠肺组织结构清晰，未见明显炎症细胞浸润及上皮下的蓝色胶原沉积;博来霉素组小鼠肺组织结构紊乱，肺间质可见炎症细胞浸润，上皮下的蓝色胶原沉积明显增加;吉非替尼干预组小鼠肺组织的肺泡壁稍增厚，有少量炎症细胞浸润，但结构基本完整，伴有少量蓝色胶原沉积。肺组织纤维化程度的评分参照Ashcroft[8]法。三组小鼠肺组织纤维化程度评分依次为(1.40±0.55)、(5.60±1.14)、(2.80±0.45)分，博来霉素组小鼠肺组织纤维化程度评分较对照组的升高（P＜0.01），吉非替尼干预组小鼠肺组织纤维化程度评分较博来霉素组的下降（P＜0.01)，较对照组的升高（P＜0.05)。
1.3 三组小鼠肺组织α-SMA mRNA表达水平
三组小鼠肺组织α-SMA mRNA表达水平的差异具有统计学意义（F=15.690，P=0.001）。博来霉素组小鼠肺组织α-SMA mRNA表达水平较对照组的升高(1.72±0.44比0.80±0.12，P＜0.01);吉非替尼干预组小鼠肺组织α-SMA mRNA表达水平较博来霉素组的降低(0.80±0.10比1.72±0.44，P＜0.01)，较对照组的降低(0.80±0.10比0.80±0.12，P=1.000)。
1.4 三组小鼠肺组织E-Cadherin mRNA表达水平
三组小鼠肺组织E-Cadherin mRNA表达水平的差异具有统计学意义（F=16.665，P=0.001）。博来霉素组小鼠肺组织E-Cadherin mRNA表达水平较对照组的降低(0.13±0.02比0.31±0.08，P＜0.01);吉非替尼干预组小鼠肺组织E-Cadherin mRNA表达水平较博来霉素组的升高（0.33±0.05比0.13±0.02，P＜0.01)，较对照组的升高(0.33±0.05比0.31±0.08,P=1.00)。
1.5 三组小鼠肺组织Foxo3a mRNA表达水平
三组小鼠肺组织Foxo3a mRNA表达水平的差异不具有统计学意义（F=0.575，P=0.582）。博来霉素组小鼠肺组织Foxo3a mRNA表达水平较对照组的降低(0.60±0.32比0.74±0.39，P=1.000);吉非替尼干预组小鼠肺组织Foxo3a mRNA表达水平较博来霉素组的升高（0.97±0.69比0.60±0.32，P=0.950），较对照组的升高(0.97±0.69比0.74±0.39,P=1.000)。
1.6 三组小鼠肺组织Foxm1mRNA表达水平
三组小鼠肺组织Foxm1mRNA表达水平的差异不具有统计学意义（F=0.648，P=0.546）。博来霉素组小鼠肺组织Foxm1mRNA表达水平较对照组的升高(0.22±0.16比0.13±0.09，P=1.000);吉非替尼干预组小鼠肺组织Foxm1mRNA表达水平较博来霉素组的升高(0.26±0.24比0.22±0.16，P=1.000)，较对照组的升高(0.26±0.24比0.13±0.09,P=0.887)。
1.7 三组小鼠肺组织Snail1mRNA表达水平
三组小鼠肺组织Snail1mRNA表达水平的差异具有统计学意义（F=33.487，P=0.000）。博来霉素组小鼠肺组织Snail1mRNA表达水平较对照组的升高(3.22±0.52比1.35±0.24，P＜0.01);吉非替尼干预组小鼠肺组织Snail1mRNA表达水平较博来霉素组的降低（1.15±0.38比3.22±0.52，P＜0.01），较对照组的降低(1.15±0.38比1.35±0.24，P=1.000)。
结论:
Foxo3a活性的增加可负调控Snail1，下调α-SMA表达、上调E-Cadherin表达，从而减轻博来霉素诱导的小鼠肺纤维化上皮-间质转分化。