【摘 要】
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新孢子虫病(neosporosis)呈全球性分布,严重影响世界畜牧业发展。新孢子虫病可引起孕畜流产、死胎和新生幼畜先天性运动神经受损。然而,目前新孢子虫病仍无疫苗可用,鉴于此,本研究拟寻找一种可防治新孢子虫病的疫苗。自1986年a干扰素(IFN-a)被美国FDA批准应用于临床以来,多种细胞因子被用于临床疾病的预防和治疗。细胞因子与抗原组合具有提高细胞免疫水平,增强机体免疫保护的效果。白细胞介素-1
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新孢子虫病(neosporosis)呈全球性分布,严重影响世界畜牧业发展。新孢子虫病可引起孕畜流产、死胎和新生幼畜先天性运动神经受损。然而,目前新孢子虫病仍无疫苗可用,鉴于此,本研究拟寻找一种可防治新孢子虫病的疫苗。自1986年a干扰素(IFN-a)被美国FDA批准应用于临床以来,多种细胞因子被用于临床疾病的预防和治疗。细胞因子与抗原组合具有提高细胞免疫水平,增强机体免疫保护的效果。白细胞介素-18(IL-18)是一种作用效果非常强的佐剂分子,可促使机体Th1型免疫的发生,诱导产生对胞内病原具有杀伤力的γ-干扰素(IFN-γ),因而被当作重要的疫苗佐剂进行研究。新孢子虫致密颗粒7(NcGRA7)是新孢子虫病疫苗研究主要抗原之一。因而,我们拟探究NcGRA7与IL-18重组(NcGRA7-IL-18)表达蛋白在Balb/C鼠抗新孢虫感染中的免疫保护效果。本研究通过PCR方法扩增NcGRA7、IL-18基因,通过无缝克隆(In-Fusion Cloning)方法扩增NcGRA7-IL-18基因,构建pMD18-T-NcGRA7、pMD18-T-IL-18、pMD18-T-NcGRA7-IL-18克隆载体和pET-32a-NcGRA7、pET-32a-IL-18、pET-32a-NcGRA7-IL-18表达载体,将表达载体转入BL21(DE3)感受态中进行蛋白诱导表达。SDS-PAGE和western blot进行目的蛋白表达和纯化鉴定。免疫效果通过免疫类型(Th1/Th2)、小鼠感染新孢子虫后的存活率和荧光定量的方法对小鼠组织器官(心、肝、脾、肺、肾、脑)检测到的新孢子虫DNA情况等指标综合评价。试验结果如下:(1)基因扩增和载体构建结果:成功扩增出了NcGRA7、IL-18、NcGRA7-IL-18基因、构建了pMD18-T-NcGRA7、pMD18-T-IL-18、pMD18-T-NcGRA7-IL-18克隆载体和pET-32a-NcGRA7、pET-32a-IL-18、pET-32a-NcGRA7-IL-18表达载体。(2)蛋白表达结果:成功在BL21(DE3)感受态中表达和纯化出NcGRA7、IL-18、NcGRA7-IL-18蛋白并对蛋白表达量进行了优化。(3)抗体检测结果:对Balb/c鼠进行了三次免疫,NcGRA7-IL-18免疫组特异性抗体效价可达1:409600以上;二免7天后,NcGRA7-IL-18免疫组IgG1极显著(P<0.01)高于PBS组,IgG2a组间无差异(P>0.05)。(4)细胞因子的检测结果:三免后小鼠血清中并未检测到IFN-γ,新孢子虫裂解抗原(NLA)刺激脾淋巴细胞NcGRA7-IL-18免疫组产生的IFN-γ量与PBS组无差异(P>0.05),产生的IL-4量NcGRA7-IL-18免疫组高于PBS组(P<0.01)。采用纯化出的NcGRA7-IL-18蛋白和NcGRA7蛋白分别对小鼠脾淋巴细胞进行刺激,NcGRA7-IL-18蛋白刺激产生的IFN-γ量高于NcGRA7蛋白刺激产生的IFN-γ量(P<0.05)。(5)攻虫感染结果:每组4只小鼠进行攻虫感染,每只小鼠感染2×10~7个新孢子虫,感染新孢子虫后NcGRA7-IL-18组在第17天时死亡1只小鼠,剩余3只在40天内均未死亡,免疫蛋白NcGRA7-IL-18保护率为75%。PBS组4只小鼠则在8天内全部死亡。荧光定量PCR方法检测新孢子虫,Balb/c鼠心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、大脑均可检测到新孢子虫DAN。NcGRA7-IL-18组死亡的1只鼠的肝脏、脾脏、肺脏中检测出新孢子虫DNA,存活的3只小鼠中有1只小鼠未检测到新孢子虫DNA。PBS组中4只小鼠中均在脏器中检测到新孢子虫DNA。结论:Balb/c鼠在NcGRA7-IL-18重组蛋白免疫下产生Th2型免疫应答,NcGRA7-IL-18重组蛋白对Balb/c鼠抗新孢子虫感染具有免疫保护效果。
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