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[实验目的]评价9种天然产物的细胞毒性,分析构效关系和自由基相关机制；研究5种氮芥和倍半萜结合成的新化合物-氮芥倍半萜的作用特点,对抗肿瘤药物研发进行初步探索。[实验方法]以人肝癌细胞株SMMC-7721.人子宫颈癌细胞株HeLa.人急性髓性白血病细胞株HL-60、人肝癌细胞株HepG2和人正常肝细胞株L02为模型,用SRB法和台盼蓝排染法测定细胞毒性,用DCFH-DA荧光分光光度法测定细胞活性氧生成,用钼酸铵比色法检测过氧化氢酶活力。受试化合物主要包括如下3类：(1)7种二萜类化合物(编号1-7)；(2)2种苯并呋喃类化合物(编号BF-1、BF-2)；(3)5种苯甲酸氮芥倍半萜(编号BNMS-1-BNMS-5).苯甲酸氮芥(benzoic nitrogen mustard,BNM)和倍半萜1β-氧代-对[N,N-二(2-氯乙基氨基)]苯甲酰基-5α-羟基-4(15),10(14),11(13)-三烯-6α,12-桉烷内酯(S)。[实验结果](1)二萜类化合物(1)、(6)对SMMC-7721、HeLa和HL-60等三种细胞的IC50值均小于4μg/mL.显示出很强的细胞毒性；化合物(2)、(3)、(4)对三种细胞的IC50值介于2-33μg/mL之间,显示出了较强的细胞毒性；化合物(5)和(7)对三种细胞的IC50值介于26-126μg/mL之间,毒性相对较弱。(2)苯并呋喃类化合物BF-1和BF-2对正常肝细胞系L02的IC50值分别为171.2±3.3μg/mL和79.0±4.1μg/mL,高于对肝癌细胞系HepG2的IC50值84.2±6.5μg/mL和65.2±1.9μg/mL,表明肿瘤细胞比正常细胞对化合物更加敏感。用化合物BF-1和BF-2 IC50处理细胞48 h,测得HepG2细胞活性氧分别是对照组的1.6倍和3.2倍;L02细胞活性氧分别是对照组的1.2倍和1.8倍。化合物BF-1和BF-2处理后,HepG2细胞过氧化氢酶活力分别从对照组的17.2±1.7 U/mg Pr.下降到12.8±0.4和6.4±0.1 U/mg Pr.；L02细胞过氧化氢酶活力分别从对照组的17.7±1.2 U/mg Pr.下降到14.3±1.5和8.6±0.5 U/mmgPr.; HepG2过氧化氢酶活力降低幅度大于L02。(3)苯甲酸氮芥倍半萜BNMS-1对SMMC-7721.HeLa.HL-60和L02的IC50值介于99.2-161.2μg/mL, BNMS-2.BNMS-3和BNMS-4对这四种细胞的IC50值介于6.6-29.7μg/mL之间。根据SRB测得的IC50值,得出化合物细胞毒性由强到弱的顺序为：BNMS-3>BNMS-2≈BNMS-4>BNMS-1.BNMS-3双键位于C3和C4以及C11和C13间(α-亚甲基-γ-丁内酯基),毒性最大；若BNMS-3的C3至C4间双键移位至C4至C15间,C11与C13间双键变成单键(α-亚甲基-γ-丁内酯基被破坏)即为BNMS-1,毒性最弱；若BNMS-3的C11与C13间双键不变,C3与C4间双键移位至C4与C15间即为BNMS-2,毒性减弱；若BNMS-3的C3与C4间双键不变,C11与C13间双键加成为单键即为BNMS-4,毒性减弱；且BNMS-2和BNMS-4细胞毒性相当,处于BNMS-1和BNMS-3之间。(4)通过比较BNMS-5与合成它所用的倍半萜(苯甲酰基-4(15),10(14),11(13)-三烯-6α,12-桉烷内酯倍半萜,代号S)对HepG2和L02的细胞毒性差异,发现化合物S、BNMS-5对细胞的IC50值均小于100μg/mL,化合物S对肝癌细胞系HepG2有选择性,且细胞活性氧随S处理浓度增加而增加;而BNMS-5对HepG2细胞无选择性,对ROS的诱导也无此浓度依赖趋势,其细胞毒性作用与活性氧机制无关。[实验结论](1)构效关系分析发现,7种二萜类化合物的构效关系支持α-亚甲基环戊酮结构为该类化合物毒性中心的观点；羟基在此类化合物的细胞毒作用中起抑制作用,羟基数越多,化合物的细胞毒性越小,而羟基的位置变化对细胞毒性影响比羟基数目的影响小。(2)苯丙呋喃类衍生物BF-1、BF-2对肝癌细胞系HepG2作用强,对正常肝细胞系L02的作用弱,对肿瘤细胞具有选择性毒性。化合物BF-1、BF-2对HepG2的毒性和促使细胞产生活性氧的增幅均大于L02,同时二化合物作用使HepG2过氧化氢酶活力降幅也大于L02,据此推测二化合物细胞毒性与活性氧有关。(3)通过对BNMS-1、BNMS-2、BNMS-3和BNMS-4的构效关系分析发现,C3和C4位间的双键以及α-亚甲基-γ-丁内酯基(C11与C13间为双键)对细胞毒活性至关重要,二者对活性的贡献基本一致。(4)通过比较倍半萜与BNMS-5的细胞毒性发现,倍半萜对肿瘤细胞HepG2的细胞毒性具有选择性,其机制与活性氧相关；在倍半萜上连接氮芥之后,新的氮芥倍半萜化合物(BNMS-5)的细胞毒性增强,但是对肿瘤细胞的选择性消失,其作用机制也失去了与活性氧的相关性。