【摘 要】
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茉莉酸甲酯(methyljasmonate,MeJA)作为植物体内重要的信号分子,可以诱导植物的抗氧化酶活性、降低膜脂过氧化和维持活性氧(reactive oxygen species,ROS)代谢平衡,提高多种园艺作物的耐寒性。MYC2是茉莉酸(jasmonacid,JA)信号途径中的初级转录因子,参与了 MeJA介导的各种代谢反应,但目前关于MYC2在MeJA介导的果蔬耐寒性中的作用机制仍缺乏
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茉莉酸甲酯(methyljasmonate,MeJA)作为植物体内重要的信号分子,可以诱导植物的抗氧化酶活性、降低膜脂过氧化和维持活性氧(reactive oxygen species,ROS)代谢平衡,提高多种园艺作物的耐寒性。MYC2是茉莉酸(jasmonacid,JA)信号途径中的初级转录因子,参与了 MeJA介导的各种代谢反应,但目前关于MYC2在MeJA介导的果蔬耐寒性中的作用机制仍缺乏更全面的认识。抗坏血酸-谷胱甘肽(ascorbate-glutathione,AsA-GSH)循环是植物体内主要的抗氧化防御系统,通过调节ROS的平衡,在植物的生长发育和减轻胁迫诱导的氧化损伤中发挥关键作用。但目前关于低温胁迫下MeJA调控AsA-GSH循环的潜在分子机制仍不清楚,亟待深入研究。本实验通过病毒诱导基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)技术构建SlMYC2基因沉默番茄,并通过0.05 mmol L-1 MeJA熏蒸处理,研究2℃低温胁迫下番茄果实的冷害(chilling injury,CI)情况及AsA-GSH循环中关键物质、酶和基因的变化,确定SlMYC2在MeJA诱导AsA-GSH循环提高番茄果实抗冷性中的作用;通过生物信息学分析初步筛选SlMYC2调控AsA-GSH循环的靶基因,并利用凝胶阻滞分析技术(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)和双荧光素酶报告基因分析(dual-luciferase reporter assays,DLR)确定了 SlMYC2 对 AsA-GSH 循环的靶向调节作用;通过酵母双杂交(yeast two-hybrid,Y2H)和双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation,BiFC)技术对筛选到的 SlMYC2 互作蛋白 SlPP2-B12进行互作鉴定,并利用DLR初步揭示了SlPP2-B12在SlMYC2靶向调节AsA-GSH循环中的作用。主要研究结果如下:(1)0.05 mMMeJA熏蒸处理显著降低了2℃贮藏条件下番茄的CI指数、H2O2和O2·-含量,提高了 AsA-GSH循环中抗氧化物质(AsA、GSH)的含量、促进了关键酶的活性(APX、GR、MDHAR、DHAR和GST)和基因的转录水平(SlAPX2、SlAPX6、SlDHAR1、SlDHAR2、SlMDHAR和SlGSTL3),增强了番茄果实的抗冷性。(2)沉默SlMYC2显著抑制了冷胁迫中MeJA对AsA-GSH循环的诱导作用,导致番茄果实ROS含量上升,CI症状加剧,表明了 SlMYC2在MeJA介导AsA-GSH循环提高番茄抗冷性中发挥正向调控作用。(3)生物信息学分析结果表明,SlMYC2可能靶向调控AsA-GSH循环中的关键基因:SlAPX6、SlDHAR2和SlGSTL3,并通过EMSA技术初步证明了SlMYC2蛋白能够靶向作用于SlAPX6、SlDHAR2和SlGSTL3启动子顺式作用元件。(4)DLR实验表明SlMYC2能够靶向激活SlAPX6、SlDHAR2和SlGSTL3的转录活性。(5)构建了 Y2H和BIFC实验所用的载体,证明了 SlMYC2能够与SlPP2-B12蛋白相互作用。(6)构建了 pGreenⅡ 62-SK-SlPP2-B12载体,利用DLR实验初步揭示了SlPP2-B12在SlMYC2靶向激活SlAPX6、SlDHAR2和SlGSTL3的转录中发挥负调控作用。
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