第一部分 转染endostatin基因的CD34+细胞对实体瘤新生血管的局部作用 目的：探讨转染endostatin基因的CD34+细胞对实体瘤的局部作用。 方法：用电穿孔方法将重组质粒PLNCX-Endostatin转染包装细胞PA317，用G418进行筛选，提取病毒上清并用NIH3T3检测浓度。用Ficoll法分离人脐带血单个核细胞，再用免疫磁珠(MiniMACS)进一步分离CD34+造血干细胞。将病毒上清与人脐带血CD34+造血干细胞共培养。应用PCR及Westernbolt检测人Endostatin在脐带血造血干细胞中的转染、表达和分泌。MTT法检测转基因CD34+细胞上清液对血管内皮细胞的生长抑制作用。建立SMMC-7721系肝癌Balb/c裸鼠移植瘤模型，瘤体局部注射转基因CD34+细胞，观察瘤体生长抑制率，免疫组织化学法检测CD105、PCNA的阳性表达，用DNA原位末端标记(TUNEL)方法检测细胞凋亡。瘤体组织匀浆以Westernbolt检测Endostatin蛋白表达。 结果：经PCR证实，转染Endostatin基因的人脐带血CD34+造血干细胞基因组中存在有550 bp Endostatin人特异性片段，Westernbolt分析示人Endostatin在转染细胞中获得稳定表达和分泌。VEC-304细胞在转基因CD34+细胞上清液培养，MTT法检测增殖率减少了59.9％。注射转基因细胞是瘤体体积减少约31.39％。血管密度(CD105阳性率)也减少了62.45％，PCNA阳性率相应降低，细胞凋亡指数(AI)增加，western blot检测种植转基因细胞的瘤体组织中endostatin蛋白也呈阳性表达。 结论：采用肿瘤局部植入转染Endostatin基因CD34+细胞可以抑制鼠负荷瘤的新生血管增生，延缓肿瘤进展。 第二部分 核转录因子及其抑制蛋白在超声损伤血管内皮细胞过程中的序贯性变化 目的：探讨超声联合超声造影剂损伤血管内皮细胞过程中，所引起的核转录因子NF-κB及IκBα序贯性变化。 方法：以低频(20KHz，0.5w)超声辐射微泡剂(碳酸氢钠，维生素C)血管内皮细胞株(EVC-304)，分别辐射60秒、90秒、120秒和50秒。MTT法检测细胞增殖抑制率以选择较佳的超声照射时间和照射后继续培养的时间；流式细胞仪检测细胞的凋亡；透射电镜检测细胞形态的改变；应用分光光度法检测细胞培养液中活性氧自由基(ROS)的活力和超氧化物歧化酶(SOD)的活力；Westernblot检测在超声作用后1小时的NF-κB蛋白表达水平和作用后24小时的IκBα蛋白表达水平。 结果：超声联合微泡剂处理这些细胞120秒后继续培养24小时，VEC-304细胞的生存率为胞为51±3.5％(P<0.01，与其它对照组比较)。电镜和倒置显微镜下观察到细胞凋亡小体出现和其它细胞损伤性改变。流式细胞仪检测细胞凋亡率比对照各组增加(21.15±4.68％，EVC-304 cells；P<0.01)。超声辐射120秒后培养60分钟，培养基中的ROS明显升高((833.14±07.23U/ml vs94.18±4.10U/ml，P<0.01)，而SOD活力下降(69.52±2.81U/ml vs168.42±2.54，P<0.01)。NF-κB增强的表达出现在超声辐射后60分钟，IκBα明显表达出现在超声处理后24小时。 结论：氧自由基清除酶SOD活力下降提示超声联合微泡剂损伤这些细胞时氧自由基增加。同时，NF-κB短时性的表达可能是氧自由基刺激的结果。NF-κB和IκBα在超声作用后的序惯性表达提示，它们可能参与和调节超声与微泡造影剂损伤细胞的反应过程。