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肝癌和白血病都是世界上最普遍的恶性肿瘤之一,虽然现在针对这两种疾病临床上采取了手术、非手术方式的药物治疗及手术与药物治疗相结合的疗法,但对这两种疾病的治疗效果并不完全令人满意。另外,手术治疗受肿瘤的大小、位置、肿瘤转移等因素的影响,并不是在任何时候都能实施。虽然有些西药也用于治疗这两种疾病,但长期服用会有较大的毒副作用,因而从天然活性物质中寻找并开发有效低毒的治疗药物变得非常迫切。本课题的目的就是：从红树林植物海芒果(Cerbera manghas L.)来源的化合物中筛选抗肿瘤活性物质并进一步研究其可能的作用机理。 方法：利用MTT法研究从海芒果中提取的化合物对人肝癌细胞HepG2、人正常肝细胞张氏肝(Chang Liver)和人白血病细胞HL-60增殖的影响；利用吖啶橙(AO)/溴化乙锭(EB)双染的方法从形态学上观察化合物对细胞凋亡作用的影响；利用碘化丙啶(PI)单染、Annexin V-FITC和PI双染后流式细胞仪分析,及DNA片断化分析法(DNA fragment assay)进一步证实化合物是否诱导肿瘤细胞的凋亡作用；利用荧光定量RT-PCR(Real-time RT-PCR)观察化合物作用细胞后,对与细胞周期与凋亡相关基因表达的影响；利用Caspase检测试剂盒检测化合物作用细胞后对细胞Caspase-3,-8,-9酶活力的影响；运用western blot的方法观察GHSC-79作用后Fas、FasL蛋白表达水平的变化。结果表明,海芒果果实提取的化合物GHSC-71-GHSC-81对HepG2和HL-60细胞均有一定程度的抑制作用,其中HepG2细胞对化合物GHSC-75最敏感,HL-60细胞对化合物GHSC-79最敏感,两种化合物在25μg/ml的浓度下对细胞的抑制率都达到了98％；进一步在化合物GHSC-75对HepG2细胞增殖影响的研究中发现,GHSC-75对HepG2细胞的抑制作用呈现浓度和时间依赖性,在作用HepG2细胞12 h,24 h,48h和72 h后,IC50分别为：192.61±0.19,26.28±0.25,5.79±0.31,1.85±0.13μM,但对人正常肝细胞Chang Liver显示出较低的毒性。流式细胞分析显示,化合物GHSC-75作用HepG2细胞后,细胞的凋亡作用并不明显,而HepG2细胞的细胞周期被阻滞在S期和G2/M期。Real-time RT-PCR结果表明,随着化合物GHSC-75作用浓度的递增,周期蛋白依赖性激酶抑制剂p21的基因表达相应增加,而与细胞周期S期到G2期过渡相关的周期蛋白激酶CDK2基因表达呈下降趋势；我们又在化合物GHSC-79对HL-60细胞影响的研究中发现,GHSC-79对HL-60细胞抑制作用也呈浓度和时间依赖性,当浓度低于0.11μM时GHSC-79对HL-60细胞没有明显的抑制作用,作用12h,24 h,48 h后,IC50分别为：9.73±0.23,3.40±0.14,2.15±0.16μM。AO/EB染色后,荧光显微镜下发现细胞核有明显的核邹缩,出现凋亡小体等凋亡细胞形态。DNA含量和细胞周期分析结果显示,在0,1.15,2.87,5.73,8.60,和11.47μM的GHSC-79作用24 h后,凋亡细胞率升高呈浓度依赖性,分别为1.74％,1.92％,6.70％,12.38％,17.25％,20.55％,同时细胞被阻滞在G2/M和S期。Annexin V-FITC/PI双染后流式细胞仪分析结果,早期凋亡细胞率呈现浓度和时间依赖性,在0,1.15,2.87,5.73,8.60,和11.47μM GHSC-79作用24 h后早期凋亡细胞率分别为0.27％,7.52％,12.45％,17.34％,20.49％,21.57％。5.73μM的GHSC-79处理细胞12 h后与对照(0.89％)相比,处理组的早期凋亡细胞数明显升高(9％);处理24 h后与对照(0.73％)相比,处理组的早期凋亡细胞数继续上升(14.67％)。DNA片断化分析结果显示,与对照相比,GHSC-79处理组作用细胞48 h后出现明显的梯形条带,充分证实化合物GHSC-79具有诱导HL-60细胞凋亡的作用。在Caspase-3,-8,-9酶活力检测中,当5.73μM GHSC-79处理HL-60细胞后Caspase-3的活性升高比较明显,在处理3 h,6 h,12 h和24 h后Caspase-3酶活性分别为对照组的3.81倍(P<0.05),5.88倍(P<0.05),18.75倍(P<0.01),30.7倍(P<0.01)。Caspase-8,Caspase-9酶的活性在5.73μMGHSC-79处理15 min后就开始升高,分别为对照的1.7倍(P<0.01)和1.36倍(P<0.05)。虽然Caspase-8,Caspase-9酶的活性随着处理时间的增加有所波动,但与对照相比,Caspase-8,Caspase-9酶的活性总体都呈上升趋势。实验中我们又发现GHSC-79处理后,能使死亡配体FasL的基因和蛋白水平相应增加。
结论：本课题中,我们从红树林植物海芒果果实中提取的一系列皂苷类化合物(GHSC-71-GHSC-81)对肝癌细胞HepG2和白血病细胞HL-60均有一定程度的抑制作用。其中GHSC-75对HepG2细胞的抑制作用最强；GHSC-79对HL-60细胞的抑制作用最强；从GHSC-75对HepG2细胞增殖抑制的研究中发现:GHSC-75通过细胞周期S期和G2/M期的阻滞,能明显抑制肝癌细胞HepG2细胞的增殖,并且伴随着细胞周期蛋白激酶抑制剂p21基因表达的上调和S/G2期周期过渡相关的激酶Cdk2基因表达的下降。同时GHSC-75对正常肝细胞Chang Liver显示出较低的敏感性；从GHSC-79对HL-60细胞增殖抑制的研究中发现:GHSC-79具有诱导HL-60细胞凋亡的作用,同时也能使HL-60细胞周期阻滞在S期和G2/M期。进一步对其机理研究说明,GHSC-79诱导HL-60细胞凋亡属于Caspase依赖的凋亡途径,并与死亡受体Fas信号通路有关。