研究背景人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)活动性感染是肾移植术后早期最常见的感染之一,部分患者会发展为HCMV病,其中HCMV性肺炎进展快,治疗困难,花费高,HCMV感染引起的重症肺炎死亡率＞65%,是肾移植受者术后早期死亡的主要原因。HCMV感染肾移植患者后,不仅可通过其直接损害引起感染症候群和组织侵袭病,如肺炎、肠炎、肾炎、肝炎,还可通过间接损害引起移植物损伤,升高移植肾急、慢性排斥率,引发心脏并发症,继发霉菌和细菌感染,发生肿瘤,发生移植后糖尿病,发生器官移植后淋巴增殖紊乱性疾病(PTLD),严重影响肾移植术后患者人/肾存活率。近年来,肾移植术后早起HCMV感染发生率呈上升趋势,国内外有些移植中心已开始采取不同的预防方案,降低HCMV感染的发生率,目前主要的预防HCMV的策略包括普遍预防策略(universal prophylaxis strategy)、选择性预防策略(targeted prophylaxis strategy)和抢先(预先)治疗策略(pre-empty prophylaxis strategy)。普遍预防策略是移植后立即对所有受者在一特定时间内(通常是3个月)进行抗病毒治疗;选择性预防策略是仅针对高危患者(D~+/R~-受体、接受抗淋巴细胞抗体治疗的受体)使用更昔洛韦;抢先治疗策略是针对常规监测(通常是抗原血症和PCR检测)结果,选择易发展为HCMV病的受者使用更昔洛韦治疗。本研究通过查阅大量文献,认为抢先治疗策略更适合中国国情,具有较好的临床应用前景。目前存在的主要问题是:HCMV感染的预防仍未引起医师和患者的足够重视;患者HCMV监测方法未形成统一认识;大多数移植中心术后未进行常规定期监测HCMV;肾移植术后检测患者血、尿HCMV-DNA载量的时间段没有确定;采取抢先治疗的HCMV-DNA载量标准没有确定;抢先治疗的药物应用方式,剂量及疗程没有确定;在HCMV感染的预防方面,国内与国际的差距显而易见,还需要我们去努力和探索。本临床研究课题紧密结合临床,对临床工作有实际指导意义。本论文首先探讨了TaqMan探针实时荧光定量PCR(real-timefluorescent quantitative PCR)检测肾移植术后患者血、尿HCMV-DNA方法的临床实用价值,分析我院近年来应用实时荧光定量PCR方法动态检测HCMV-DNA载量资料,认为其与抗原血症检测一致性良好,敏感性高于抗原血症且阳性时间早于抗原血症,因此实时荧光定量PCR检测HCMV-DNA载量适合做为抢先治疗策略动态监测手段。本研究进而回顾性分析了2001年～2004年我院部分病人采用口服更昔洛韦(Ganciclovir)的普遍预防策略资料,发现虽然这一阶段的HCMV感染及死亡率有所下降,但降低程度不理想,HCMV仍然是导致术后受者早期死亡的主要原因,且HCMV性肺炎发生率无明显降低。我们在对既往的用药方案、HCMV感染特点及检测手段进行回顾性分析的基础上,对目前我中心的肾移植术后HCMV预防策略进行调整,以期采用较低成本的、简便易行的预防方案进一步降低HCMV感染的发病率、HCMV性肺炎的发病率和死亡率,减少HCMV相关并发症的发生率,减轻肾移植术后患者早期的医疗负担。第一部分实时荧光定量PCR动态监测肾移植术后患者血、尿HCMV-DNA的临床实用价值目的:探讨RT-PCR在诊断HCMV活动性感染中的临床实用价值和作为HCMV抢先治疗策略动态监测手段的可行性。方法:选取2000年8月～2001年12月期间我中心首次尸体肾移植受者45例。术后2-16周,每周同时行实时荧光定量PCR方法检测血、尿标本HCMV-DNA。免疫组织化学的催化信号扩增法检测血HCMV低基质磷蛋白65(pp65),术后17-24周,每2周检测血、尿HCMV-DNA及血pp65,术后6-12月,每月检测血、尿HCMV-DNA及血pp65。建立RT-PCR法检测HCMV-DNA的实验条件(SLAN系统,TaqMan探针针对长约86bp的人巨细胞病毒株AD-169基因组中编码启动子的一段高度保守的非编码区基因片断)。以病毒载量＞10~3copies/ml为阳性标准,只要患者血/尿标本任何一项检测结果曾为阳性,则判断该患者为HCMV阳性患者。术后随访12个月,观察HCMV-DNA载量动态变化,同时分析RT-PCR监测HCMV-DNA载量和pp65抗原血症检测手段在诊断HCMV活动性感染和指导抢先治疗中的应用价值及特点。结果:共检测1125份样本,RT-PCR检测阳性率7.20%(81/1125),病毒载量1.254×10~3～6.972×10~6copies/ml,pp65阳性率5.16%(58/1125),抗原指数5～12/2×10~5WBC;患者阳性率RT-PCR为37.80%(17/45),pp65为28.89%(13/45),Cohen’s-Kappa检验结果表明两种检测方法一致性良好。HCMV-DNA首次出现阳性时间为15～141d,中位时间52d,pp65首次出现时间为31～158d,中位时间73d,差异有统计学意义(p＜0.05)。6例(13.3%)发生HCMV性肺炎,发病时间为肾移植术后80～154天,6例患者血/尿在发病前17～51天病毒载量开始升高并＞10~3copies/ml,而仅有4例发病前出现pp65阳性。结论:RT-PCR方法检测HCMV-DNA载量结果与PP65抗原血症检测结果一致性良好、敏感性高、阳性时间早、适合做为抢先治疗策略动态监测方法。应同时检测血和尿标本,监测时间为术后6个月。第二部分回顾性分析我院肾移植术后早期HCMV感染状况及普遍预防方案的疗效目的:回顾性分析我院2001年1月～2004年12月220例肾移植患者HCMV感染发生情况、口服更昔洛韦普遍预防方案的疗效。方法:选择2001年1月至2004年12月在我院行尸肾移植随访到6月以上并具完整随访资料的受者220例。根据是否采用预防方案分为2组,A组89例为未预防组,B组131例为普遍预防组。预防方案为:口服更昔洛韦0.5gtid连续用药3月。统计因HCMV性肺炎导致的死亡人数占同时期死亡人数比例,比较两组术后6月内HCMV感染率,HCMV性肺炎发生率、合并其它感染率、急性排斥率、并发症发生情况、不良事件发生情况。结果:本组患者HCMV活动性感染的总体发生率为33.64%(74/220),其中A组41.57%(37/89),发生时间第17～142d,中位时间43d,12例发生HCMV性肺炎,死亡5例。B组HCMV活动性感染的发生率28.24%(37/131),发生时间第62～136d,中位时间78d,15例发生HCMV性肺炎,死亡2例。A组急性排斥发生率为13.48%(12/89),总的感染发生率为29.21%(26/89),WBC降低率5.62%(5/89),肝功异常率79.78%(71/89),腹泻发生率20.22%(18/89);B组急性排斥发生率为11.45%(15/131),总的感染发生率为26.71%(35/131),WBC降低率14.50%(19/131),肝功异常率74.81%(98/131),腹泻发生率16.79%(22/131)。两组HCMV活动性感染发生率、死亡率及WBC降低率比较差异有统计学意义,两组HCMV性肺炎发生率、急性排斥发生率、肝功异常的发生率、腹泻的发生率、人均住院费用和人均住院天数比较差异无统计学意义。从2001年至2004年,术后早期HCMV性肺炎导致死亡的人数比例有增加趋势,HCMV仍然是导致术后受者早期死亡的主要原因。结论:HCMV性肺炎是目前我院肾移植受者早期死亡的主要原因。口服更昔洛韦普遍预防的方案能够降低HCMV感染的发生率及死亡率,但降低幅度不满意,且不能有效降低HCMV性肺炎的发生率,有一定局限性。第三部分肾移植术后HCMV性肺炎抢先治疗策略的临床研究目的:探讨RT-PCR动态监测肾移植术后HCMV载量的抢先治疗方案预防HCMV性肺炎的临床疗效和安全性。方法:2005年1月～2008年4月期间我院行首次同种异体肾移植(尸体/活体亲属)患者242例,随机分为2组,实验组127例,对照组115例。实验组RT-PCR法定期检测血、尿标本HCMV-DNA,术后2-16周,每周检测血、尿HCMV-DNA,术后17-24周,每2周检测血、尿HCMV-DNA。HCMV-DNA拷贝数＞1×10~3copies/ml为阳性,血、尿任何一项出现HCMV阳性者,连续静脉滴注更昔洛韦4周,剂量严格根据患者肌酐清除率计算。对于出现临床症状的按HCMV性肺炎治疗。对照组115例RT-PCR法不进行定期检测血、尿HCMV,只有当出现临床症状,怀疑为HCMV感染时,才进行检测,诊断为HCMV性肺炎者按HCMV性肺炎治疗。比较两组患者HCMV性肺炎发生情况,并发症及不良事件发生率。结果:HCMV性肺炎发生率实验组6.30%(8/127),对照组14.78%(17/115);HCMV性肺炎发生时间实验组为术后46～167d,中位时间84d,对照组为术后34～138d,中位时间51d;HCMV性肺炎死亡率实验组0.79%(1/127),对照组5.22%(6/115);发生HCMV性肺炎的呼吸机使用率实验组12.5%(1/8),对照组58.82%(10/17);肺部合并其他病原体感染率实验组12.5%(1/8),对照组64.71%(11/17);急性排斥发生率实验组为5.51%(7/127),对照组发生率为15.65%(18/115);1年人/肾存活率实验组98.42%(125/127)/97.64%(124/127),对照组93.04%(107/115)/91.30%(105/115);患HCMV性肺炎者人均住院费用实验组12864±6526元,对照组24975±18924元;肝功异常发生率实验组15.74%(20/127),对照组29.57%(34/115);腹泻发生率实验组10.23%(13/127),对照组21.73%(25/115);各数据比较差异均有统计学意义(p＜0.05)。发生HCMV性肺炎患者人均住院天数实验组32±14天,对照组37±29天;6个月时实验组总的感染发生率为27.56%(35/127),对照组为33.91%(39/115);两组比较无统计学差异(p＞0.05)。术后半年内两组患者肾功能及两组WBC降低的发生率比较差异无统计学意义(P＞0.05)。应用更昔洛韦抗病毒治疗未见严重不良反应。结论:抢先治疗能有效预防肾移植术后HCMV性肺炎的发生,降低HCMV性肺炎的发生率和死亡率,提高肾移植术后1年人/肾存活率。严格按照患者肌酐清除率计算用量,静脉应用更昔洛韦4周的抢先治疗具有良好的安全性。