一、研究背景由于燃料废气的排放,吸烟及工作环境等原因,各种有害致癌物质会严重改变正常肺组织生存的微环境,导致炎症疾病外,甚至引起肺部肿瘤的发生。据统计,2013年中国的癌症患者中,肺癌患者人数在男性中处于首位,在女性患者中仅次于乳腺癌。此外,因癌症而死亡的患者中,肺癌患者占到了第一位。肺癌的治疗主要包括手术、化疗、放疗及靶向治疗有四种方式。然而,每一种治疗手段都是一把双刃剑,既有其独特的优势,也有不可忽视的缺点。其中,放疗在肺癌的早期及晚期治疗中有着重要的作用,但是放疗在通过射线杀死肿瘤的同时,不可避免的对放射野内正常肺组织产生不必要的损伤,导致放射性肺炎的产生,严重影响患者的预后情况。其次,由于部分肿瘤细胞本身对辐射的抵抗性,增加临床放疗剂量的同时,又会加重对正常肺组织的损伤。目前,针对临床放射性肺炎的治疗主要是通过给予糖皮质激素缓解病人症状,而长时间使用激素会对人体带来严重的副作用。因此,我们研究的目的是为了找出一种在放疗中既能保护正常肺组织又能增强肿瘤治疗的药物。原花青素是目前已知的抗氧化能力最强的天然提取物,远高于日常使用的维生素C及维生素E。其具有来源广泛,提取成本低,毒性低及水溶性好的优势。此外,原花青素的生物体内的半数致死剂量超过5000mg/kg,远远大于治疗剂量。原花青素对肺组织相关炎症及疾病具有较好的治疗作用:原花青素可以有效减轻角夹胶诱导的肺组织急性炎症反应,减轻小鼠哮喘模型的急性气道炎症反应,抑制肺水肿的形成,且对博来霉素诱导的肺炎具有很好的治疗作用。本实验室前期研究成果发现,原花青素可以显著减轻辐照后早期放射性肺炎的炎症渗出和晚期放射性肺纤维化的发生,降低辐射所导致的肺组织上皮间质转化程度,减轻炎症因子TGF-β1、ET-1、IFN-γ、IL-4和IL-13的改变程度。另外,与其他抗氧化剂不同的是,原花青素是一种缓释抗氧化剂,他可以在血液和组织中存留7-10天,发挥持续的抗氧化作用,这对于病情进行性进展的放射性肺损伤的防治具有独到的优势。此外,原花青素还具有抗肿瘤作用。过去的十年体外细胞实验和动物实验均已经证明原花青素对皮肤癌,乳腺癌,前列腺癌,头颈部肿瘤和肺癌等肿瘤细胞增殖具有明确抑制作用。研究者还在体外实验中证实原花青素对正常细胞的生长和活力没有明显影响,而只对肿瘤细胞表现出杀伤作用。综合以上的特点,我们推测,原花青素有希望在肺癌放疗过程中,防护放射野内正常的肺组织的同时,对肺癌细胞又起到抑制增殖的作用。本课题将重点研究原花青素在肺癌放疗中的双向作用及其分子机制。二、研究内容（一）小鼠原位肺癌荷瘤模型的建立。通过原位肺内注射法建立原位肺癌模型。特点:以左肺上叶作为肺癌细胞的生长环境,通过基质胶固定细胞位置。（二）原花青素在肺癌放疗中的双向作用。1、原花青素在细胞作用中的研究。（1）通过CCK8检测原花青素在小鼠正常肺上皮细胞MLE-12及人正常肺上皮细胞BEAS-2B中的毒性;（2）通过流式检测及克隆形成率实验检测原花青素对肺正常细胞的辐射防护作用及对肺肿瘤细胞的辐射增敏作用。2、原花青素在肺癌模型中的作用。（1）原花青素能够抑制小鼠肿瘤的生长及转移（1）原花青素抑制小鼠皮下肿瘤的生长;（2）原花青素抑制小鼠肿瘤的转移。（2）原花青素影响荷瘤小鼠局照后的生存状况;（3）原花青素对荷瘤小鼠局照后肿瘤大小及肺叶重量的影响;（4）原花青素减少荷瘤小鼠局照后正常肺组织的炎性渗出;（5）原花青素能够减少小鼠肺正常组织照射后的凋亡,而促进照射后肿瘤组织的凋亡,同时抑制其增值;（6）原花青素能够调节Th1/Th2相关细胞因子IL-6及IFN-γ的分泌。（三）原花青素在肺癌放疗中双向作用的机制研究。1、原花青素可以明显降低辐照后A549及BEAS-2B细胞中活性氧的产生;2、原花青素对肺正常细胞及肿瘤细胞内的p-ERK、p-JNK及p-P38表达情况的影响具有差异;3、原花青素可以激活肺正常细胞及肿瘤细胞Sirt6蛋白的表达;4、研究肺正常细胞及肿瘤细胞过表达Sirt6蛋白后p-ERK、p-JNK及p-P38的表达情况;5、通过抑制p-ERK、p-JNK及p-P38蛋白的表达,观察Sirt6的表达情况,判断Sirt6蛋白在原花青素中的作用。三、研究方法（一）建立小鼠原位肺癌荷瘤模型及肺部局部放射模型。1、用胰岛素注射器将肿瘤细胞与基质胶的混悬液注射入小鼠左上肺叶,建立小鼠肺部原位肺癌荷瘤模型;2、使用本实验室设计的固定小鼠模具,采取铅块遮挡的方式建立肺部局照放射模型;3、照射方式:采用25Gy⁶⁰Coγ射线单次照射,剂量率为1Gy/min。（二）研究原花青素在肺癌放疗中的双向作用1、选取小鼠肺上皮细胞MLE-12、肺癌细胞LLC及人正常肺上皮细胞BEAS-2B、肺腺癌细胞A549进行试验;（1）细胞分组:对照组、原花青素处理组、照射组、照射组加原花青素处理组,每种细胞分组相同,照射剂量为8Gy;（2）细胞照射及原花青素处理后对正常细胞及肿瘤细胞增殖能力的影响:流式细胞仪检测及克隆形成率;2、在小鼠原位肺癌荷瘤模型的基础上检测原花青素的双向作用（1）小鼠分为:假手术对照组、假手术肺部照射组、肺部荷瘤对照组、肺部荷瘤原花青素处理组、肺部荷瘤照射组及肺部荷瘤原花青素加照射组,共6组,每组选用雄性8周C57BL/6小鼠3只;（2）原花青素及照射对原位荷瘤小鼠的生存影响:检测荷瘤小鼠生存期及体重;（3）原花青素及照射对原位荷瘤小鼠肿瘤的影响:检测肿瘤大小,H&E染色及小鼠左上肺叶重量;（4）免疫荧光检测正常肺组织及肿瘤组织的增殖和凋亡:Ki67和p53染色;（5）检测原花青素对小鼠免疫细胞因子的影响:用ELISA方法检测小鼠血清细胞因子IL-6和IFN-γ。（三）原花青素在肺癌放疗中双向作用的分子机制1、检测原花青素对照射后细胞内活性氧的清除:ROS检测试剂盒;2、检测原花青素对照射后细胞内相关蛋白变化的影响:Western blot;3、检测原花青素对照射后原位荷瘤小鼠正常肺组织及肿瘤组织蛋白的影响:Western blot;4、通过改变细胞内Sirt6的表达检测p-ERK、p-JNK及p-P38蛋白的表达:Sirt6过表达质粒的转染、Western blot;5、通过选取抑制剂S1805、SP600125及SB203580分别抑制p-ERK、p-JNK及p-P38蛋白的表达,观察Sirt6的表达情况:Western blot。四、实验结果（一）成功建立小鼠原位肺癌荷瘤模型及肺部局部放射模型1、成功建立小鼠左上肺叶原位肺癌荷瘤模型,肿瘤生长符合实验要求;2、成功建立荷瘤小鼠肺部局部照射模型。（二）原花青素在肺正常细胞及肿瘤细胞放疗中的双向作用1、对小鼠肺正常及肿瘤细胞的双向研究:通过流式细胞仪检测,发现原花青素能够减少小鼠肺上皮细胞MLE-12照射后的凋亡;通过克隆形成率实验,原花青素对小鼠肺上皮细胞MLE-12具有辐射防护作用,对小鼠肺癌细胞LLC具有辐射增敏作用;2、对人肺正常及肿瘤细胞的双向研究:通过流式细胞仪检测,发现原花青素能够减少人正常肺上皮细胞BEAS-2B凋亡且促进人肺腺癌细胞A549的凋亡;通过克隆形成率实验,原花青素对人正常肺上皮细胞BEAS-2B细胞具有辐射防护作用,且能够抑制人肺腺癌细胞A549的生长,具有辐射增敏作用;（三）原花青素在原位肺癌荷瘤小鼠放疗中的双向作用研究1、通过观察并记录原位肺癌荷瘤小鼠的生存情况,发现:原花青素处理加照射组相比于照射组,其存活时间更长;2、通过对小鼠肺内肿瘤的测量,发现:原花青素处理加照射抑制小鼠左上肺叶内肿瘤的生长,相比较于单纯照射组,效果更加明显;3、通过荧光免疫分别标记增殖相关蛋白Ki67及凋亡相关蛋白p53,发现:在小鼠正常肺组织内,原花青素加照射组与单纯照射组相比,p53表达量明显降低;在肿瘤组织内,单纯处理组的Ki67的表达量相比于对照组明显降低,而原花青素加照射组与单纯照射组相比,p53表达量明显升高;4、通过ELISA检测荷瘤小鼠血清细胞因子的表达量,发现:原花青素加照射组相比于单纯照射组,能够明显抑制IL-6、提高IFN-γ的表达,促进对肿瘤的抑制,降低炎性损伤。（四）原花青素在肺癌放疗中的可能作用机制1、原花青素能够显著清除人肺癌细胞A549及正常肺上皮细胞BEAS-2B照射后所产生的自由基;2、在人肺癌细胞A549中,原花青素明显提高照射后p-JNK蛋白的表达;在人正常肺上皮细胞BEAS-2B中,原花青素可以明显抑制p-JNK、p-ERK及p-P38的增高,而这与其能够清除活性氧自由基有关。3、在人肺癌细胞A549中,原花青素通过增加Sirt6蛋白的表达进而改变p-JNK、p-P38蛋白的变化,促进辐射增敏作用五、结论在细胞层面上我们发现,原花青素对小鼠肺癌细胞LLC及人肺癌细胞A549具有辐射增敏作用,对小鼠肺正常细胞MLE-12及人正常肺上皮细胞BEAS-2B具有辐射防护作用。在人肺癌细胞A549中,原花青素可以通过提高Sirt6蛋白的表达进而改变p-JNK、p-P38蛋白的变化,促进辐射增敏作用。在人正常肺上皮细胞BEAS-2B中,原花青素可能通过清除活性氧自由基,抑制p-JNK、p-ERK及p-P38的增高,降低炎症作用。通过建立小鼠原位肺癌的放疗模型,我们发现原花青素能提高小鼠的生存期,可以改变血清细胞因子的表达,能够减少小鼠肺正常组织的辐射损伤,同时对肿瘤具有放疗增敏的作用。