研究背景和意义胶质瘤是临床最常见的中枢神经系统恶性肿瘤,瘤细胞的无限生长和侵袭浸润是其最大的生物学特征,也是患者预后不良的最主要原因。活性氧(Reactive oxygen species,ROS)是机体正常氧代谢的副产物。ROS和氧化应激对胶质瘤的关系极其复杂,尚未完全阐明。观察胶质瘤细胞中不同ROS及氧化应激水平下胶质瘤增殖、周期、凋亡的生物学效应,对于阐明胶质瘤的发病机制和寻找新的临床治疗策略具有重要意义。利用基因芯片技术和生物信息学分析方法,从全转录水平或全DNA层面了解胶质瘤细胞的基因表达情况,筛选与胶质瘤疾病过程有关的基因表达集,为研究胶质瘤的发病机制、开发靶向性药物等提供了思路和线索。目的我们拟观察胶质瘤细胞中不同ROS及氧化应激水平对胶质瘤增殖、周期、凋亡等生物学效应的影响及机制,探索胶质瘤氧化应激水平和线粒体Caspase途径是否能作为胶质瘤治疗的潜在靶点。其次,我们分析了不同氧化应激状态下胶质瘤细胞全转录组水平的基因表达数据,从整体观察基因表达变化,筛选Caspsae 3抑制剂影响的基因集,为寻找靶向治疗胶质瘤的方法和药物等提供新的研究方向和策略。方法首先,体外培养人胶质瘤U251细胞系,用H2O2处理后,分别采用流式细胞术检测细胞内ROS水平、细胞周期和凋亡,四唑盐比色(MTT)法检测细胞增殖、免疫印迹法(Western blot,WB)检测细胞内凋亡相关蛋白Cleaved-Caspase 3、Cleaved-PARP的表达;接下来,对H2O2处理的胶质瘤U251细胞系加适当浓度的Caspase 3抑制剂干预,分别采用流式细胞术检测细胞内ROS水平、细胞周期和凋亡、MTT法检测细胞增殖、WB检测凋亡相关蛋白的表达。利用NOISeq软件包筛选Caspase 3抑制剂在氧化应激状态下引起的胶质瘤细胞差异表达基因,对差异基因进行基因本体论(Gene Ontology,GO)富集分析、京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析和药物富集分析。使用String在线工具对得到的差异表达基因进行蛋白与蛋白相互作用(Protein-protein interaction,PPI)关系预测,利用Cytoscape软件进行PPI网络图构建,使用cytoscape软件中的MCODE插件提取PPI网络中的子网络模块,对其进行功能分析;之后,利用webgestalt工具分别预测差异表达基因与微小RNA(micro RNA,mi RNA)和转录调控因子间的调控关系,并利用Cytoscape软件进行调控网络构建。结果(1)用超氧化物银离子探针(Dihydroethidium,DHE)测定终浓度100μM、300μM、500μM的H2O2处理后的胶质瘤细胞内(O2.-)水平分别为(214.33±27.14)%、(589.52±35.17)%和(643.28±31.54)%,均显著高于对照组(P<0.05);且随着H2O2浓度的增加,细胞中(O2.-)水平逐渐升高(P<0.05)。(2)用终浓度为100μM、300μM、500μM的H2O2处理后的胶质瘤U251细胞存活率为分别为(82.57±5.34)%、(23.38±6.27)%和(18.21±3.11)%,H2O2浓度越高,胶质瘤细胞存活率越低(P<0.05);(3)100μM组、300μM、500μM组胶质瘤细胞的早期凋亡率和晚期凋亡率分别为(6.21±0.88)%和(10.71±0.42)%,(24.19±2.46)%和(19.59±2.33)%,(31.78±3.07)%和(37.18±4.20)%。H2O2浓度越高,细胞凋亡率越高(P<0.05)。其中100μM组胶质瘤细胞的凋亡率与对照组无显著差异(P>0.05),300μM、500μM组胶质瘤细胞的凋亡率显著高于对照组(P<0.05)。(4)100μM组G1期、G2期和S期细胞分别占(28.79±3.64)%、(28.51±3.17)%和(46.67±2.16)%;300μM组G1期、G2期和S期细胞分别占(21.35±1.37)%、(32.48±1.62)%和(50.69±3.73)%;对照组G1期、G2期和S期细胞分别占(41.54±4.78)%、(18.51±2.35)%和(43.82±2.42)%。随着H2O2浓度升高,G1期细胞较对照组显著减少(P<0.05),G2期的细胞显著增多(P<0.05),H2O2能引起胶质瘤细胞G2期阻滞。(5)H2O2处理的胶质瘤细胞内Caspase-3前体蛋白表达显著降低,Cleaved-PARP蛋白表达显著升高(P<0.05);且升高或降低程度与H2O2浓度存在剂量依赖关系。(6)H2O2+Caspase 3抑制剂组细胞的早期凋亡和晚期凋亡率分别为(4.95±0.89)%和(8.32±1.22)%,显著低于仅用300μM H2O2处理的细胞[(23.94±2.34)%和(17.55±2.78)%]和未加任何干预的对照组细胞[(6.71±0.69)%和(11.35±1.32)%](P<0.05)。H2O2组细胞凋亡率最高,其次为对照组,H2O2+Caspase 3抑制剂组细胞凋亡率最低,Caspase 3抑制剂能显著降低H2O2诱导的胶质瘤细胞凋亡。(7)H2O2+Caspase 3抑制剂组G1期、G2期和S期细胞分别占36.05%、16.91%和47.03%;H2O2组G1期、G2期和S期细胞分别占19.88%、33.64%和46.48%;对照组G1期、G2期和S期细胞分别占41.15%、14.19%和44.66%;各组S期细胞无显著差异(P>0.05),H2O2+Caspase 3抑制剂组G1期细胞较H2O2组显著升高(P<0.05),而G2期细胞较H2O2组显著降低(P<0.05),Caspase 3抑制剂解除了H2O2引起的G2期阻滞。(8)H2O2+Caspase 3抑制剂组细胞内(O2.-)水平为(488.76±25.73)%,显著低于H2O2组的(728.17±33.65)%(P<0.05),高于对照组的(100.16±8.24)%(P<0.05)。Caspase 3抑制剂能降低H2O2处理的胶质瘤细胞内ROS水平。(9)共筛选出105个在氧化应激状态下Caspase 3抑制剂引起的与胶质瘤细胞增殖相关的差异表达基因(Differentially expressed genes,DEGs)和127个其他特异性DEGs。(10)GO分析显示与增殖相关的DEGs功能注释主要富集到细胞组分的形态发生(cellular component morphogenesis),参与的基因有FIS1、ATOH1、CCK、EZR、SSBP1和CTNNB1;受体介导的信号传导途径(Intracellular receptor-mediated signaling pathway),参与的基因有DNAJA1、CALR和CTNNB1;线粒体形态发生(Mitochondrion morphogenesis),参与的基因有FIS1和SSBP1;细胞大分子复合物亚基组织途径(Cellular macromolecular complex subunit organization),参与的基因有KIF2B、TUBB2A、SNRNP200、SNRPB、CALR和细胞器裂变(Organelle fission),参与的基因有KIF2B、FIS1、TUBB2A和DCTN3。;KEGG通路富集结果显示18个通路符合阈值要求并被显著富集,主要涉及Rho A活性调节(Regulation of Rho A activity)和Rho A信号通路(Rho A signaling pathway)、RAC1活性调节(Regulation of RAC1 activity)和RAC1信号通路(RAC1 signaling pathway)、RNA代谢(Metabolism of RNA)、蛋白质代谢(Metabolismof proteins)、雄激素受体(Androgen Receptor)、糖尿病途径(Diabetes pathways)、流感病毒感染(Influenza Infection)、细胞蛋白的凋亡裂解(Apoptotic cleavage of cellular proteins)、m RNA剪接-小通道通路(m RNA Splicing-Minor Pathway)、胰岛素合成与加工(Insulin Synthesis and Processing)、整合素(Alpha6 Beta4 Integrin)、细胞凋亡执行阶段(Apoptotic execution phase)等通路等;筛选出mi R-185、mi R-7和mi R-485-5P共3个mi RNA,与6个靶基因共同构成8个调控关系对;筛选出ETS2、NFKAPPAB、NFKB、AP1、CREL、OCT1、STAT5A、PAX3等共20个转录因子(Transcription factor,TF)与8个靶基因共同构成38个调控关系对。(11)其他127个特异性DEGs功能注释主要富集到蛋白质结合的调控(Positive regulation of protein binding),参与基因有CTHRC1、HERPUD1等;RNA聚合酶II启动子的转录调控(Transcription from RNA polymerase II promoter),参与基因有ZBTB32、NRARP等、骨骼肌细胞分化(Skeletal muscle cell differentiation),参与基因有NUPR1、LEMD2和ANKRD1;肺泡发育(Lung saccule development),参与基因有ASXL1和NKX2-1;磷脂代谢过程(Phospholipid metabolic process),参与基因有TAZ、KX2-1和LA2G4B。KEGG通路富集结果显示4个通路符合阈值要求并被显著富集,主要有糖胺聚糖的生物合成-硫酸软骨素/硫酸皮肤素途径(Glycosaminoglycan biosynthesis-chondroitin sulfate/dermatan sulfate)、糖胺聚糖的生物合成-硫酸肝素/肝素途径(Glycosaminoglycan biosynthesis-heparan sulfate/heparin)、氧化磷酸化反应(Oxidative phosphorylation)和金黄色葡萄球菌感染(Staphylococcus aureus infection)。构建的PPI网络包括82个节点和209个互作关系对;1个子网络模块包括19个节点和50个互作关系对。筛选出包括mi R-192、mi R-196、mi R-215、LET-7、mi R-299等在内共17个mi RNA,与26个靶基因构成105个调控关系对;STAT5、CEBPB、PAX6、PPAR、IRF、PPARG、CHX10、USF、CREBP1、E4BP4、HLF、PAX4共12个TF,与26个靶基因构成51个调控关系对。结论氧化应激通过线粒体-Caspase依赖性途径抑制人U251胶质瘤细胞的增殖、阻滞细胞周期进展并诱导细胞凋亡;Caspase 3抑制剂引起的氧化应激状态下胶质瘤细胞中等众多基因表达谱发生变化,特别是RPL5、PSMC5、RABGAp-TBC1D25、C1s等可能在胶质瘤的发病中起到关键作用,研究结果为未来研究胶质瘤的靶向治疗提供新的方向和策略。