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实验室前期从我国西部地区分离得到一株链霉菌,代号XBP-03,其发酵产生的次级代谢产物对多种病原菌具有抗菌活性。本论文重点进行了链霉菌XBP-03的次生代谢产物活性成分的分离纯化和结构鉴定的研究;另外,本论文还研究了用大孔吸附树脂分离枯草芽孢杆菌发酵液中的伊枯草菌素A。论文由三部分组成:
第一部分:链霉菌XBP-03的发酵液中抗菌活性物质的早期鉴别和分离纯化的研究。以蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus Ym1004)为生物活性检测供试菌株,以抑菌活性为指示,全程跟踪指导活性化合物的分离纯化。管碟法测定发酵液的效价,其效价单位相当于四环素5498.4μg;发酵液经过树脂脱色、有机溶剂沉淀除去大量色素和杂蛋白,减压蒸干得到活性物质的粗品,粗品理化性质实验结果表明,活性物质属于碱性水溶性抗生素类,极易溶于水,微溶于甲醇,且具有很好的温度和酸碱稳定性。通过以上实验完成了对发酵液中活性物质的早期鉴别,为进一步分离纯化奠定基础。经过大量筛选,确定TLC展层剂为X∶Y∶水,实现发酵液中活性物质的快速分析,确定了柱层析方法。粗品经过反复正相硅胶层析和高效液相色谱制备等步骤,分离得到两个纯化合物XBP-03-A、XBP-03-B。生物活性测定结果显示,XBP-03-A的抑菌活性较强,XBP-03-B的抑菌活性极其微弱。
第二部分:链霉菌XBP-03的次级代谢产物活性成分的结构鉴定研究。两个纯化合物的双缩脲反应显示,XBP-03-A含有至少两个酰胺键;XBP-03-A、XBP-03-B的紫外吸收峰特性与胞嘧啶核苷类化合物的类似;高分辨质谱给出XBP-03-A的分子量为443,XBP-03-B的分子量为287,它们都含有奇数个氮原子;分析XBP-03-A、XBP-03-B的1H、13CNMR(1D-NMR)、1H-1HCOSY、HSQC、HMBC以及H-HNOESY谱,并结合分析质谱和其它波谱结果,初步确定了XBP-03-A的是一种胞嘧啶核苷二肽,其化学结构与谷氏菌素相同,XBP-03-B的化学结构是胞嘧啶葡萄糖醛酸;通过文献调研,推测XBP-03-B可能是XBP-03-A生物合成的一个中间体。
第三部分:大孔吸附树脂分离枯草芽孢杆菌发酵液中的伊枯草菌素A的研究。对比不同极性大孔树脂对发酵液中伊枯草菌素A的分离效果,选择DM301型树脂作为吸附剂进行优化实验。结果表明,在25℃时,吸附剂用量为80g/LDM301型树脂时,树脂对发酵液中伊枯草菌素A的吸附率可达100%。滤去吸附残液,采用无水乙醇解吸,解吸剂用量为10ml/g干树脂,静态解吸率达90%以上。动态吸附试验表明,发酵液的最佳上样量为6倍柱床体积,动态解吸流出液活性高度集中。该工艺简单、易操作,适用于工业化生产。