α-半乳糖苷酶（α-GalActosidase）又称蜜二糖酶,在自然界中存在范围较广,属于外切糖苷酶类,能够专一催化糖链末端含α-1.6半乳糖苷键的多糖、糖蛋白、糖脂等物质,即能催化毛蕊花糖、棉籽糖、水苏糖和蜜二糖等底聚糖,还能催化一些含α-半乳糖苷键的杂多糖。目前,分离得到的α-半乳糖苷酶多为常温酶,这也极大的限制了该酶在高温行业中的使用,如饲料工业。嗜热α-半乳糖苷酶来源有限,主要分离于天然嗜热菌菌株体内,但分离过程繁琐,产量极低,不能满足于生产应用。因此,本研究利用分子生物学、微生物学和生物信息学技术,合成嗜热菌Geobacillus thermodenitrificansα-半乳糖苷酶的编码基因,利用原核表达系统来构建α-半乳糖苷酶工程菌,并研究其酶学性质和活性位点,为后续该酶的分子改造提供理论依据。本研究的主要实验内容及实验结果如下:1.本实验跟据Gen Bank数据库所提供的嗜热菌Geobacillus thermodenitrificansα-半乳糖苷酶氨基酸序列（登录号:WP＿011887668）,经人工设计Eco R I和Bam H I酶切位点,交于公司合成该编码基因。将该目的基因重组到融合表达载体p GEX-4T-3,把重组好的质粒p GEX-4T-GalA导入感受态细胞E.coil BL21（DE3）中,经验证、测序成功后获得重组工程菌E.coil BL21-p GEX-4T-GalA。2.使用生物信息学方法,发现该酶属于糖苷水解酶第36家族,理化性质结果表明,分子式为C₃₇₆₇H₅₇₅₇N₁₀₄₁O₁₀₈₃S₂₂,理论p I值为6.29该酶分子量大小为83.66KDa。在进行跨膜预测时并未发现该酶有形成跨膜区域,说明该蛋白并非是膜蛋白。在利用网络服务器PSIPRED预测蛋白二级结构时,发现该蛋白由大量的β-Sheel和α-Helix组成,并在三维结构预测中的到验证,且在三维结构中发现一个疑似活性位点的区域。3.使用IPTG对重组工程菌E.coil BL21-p GEX-4T-GalA进行了重组蛋白的诱导表达及纯化。优化结果表明28℃、0.08mmo L/L IPTG、诱导5h为最佳诱导条件,并且此时目的蛋白以可溶性形式存在,使用亲和层析方法对粗酶进行纯化,而后对纯化出来的蛋白进行浓度测定,其结果为14.443μg/m L,比酶活82.385U/mg。4以pNPG为底物,对该酶的酶学性质进行了研究,结果显示该酶最适温度为70℃、最适p H6.0、并具有良好的热稳定性和p H稳定性,Fe³⁺、Ca²⁺、Mn²⁺、Zn²⁺对α-半乳糖苷酶的活性具有不同程度的激活作用,其中以Zn²⁺对α-半乳糖苷酶的激活效果最好,Cu²⁺、Ag⁺和Hg⁺能够完全抑制酶活。对该酶的动力学常数进行测定,其结果Km为10.04mmo L/L,Vmax为18.25μmo L/min。5通过使用Auto Dock进行分子对接,选取最佳的分子构象用于分子动力学模拟,用MM-PBSA方法计算了小分子棉籽糖和α-半乳糖苷酶之间的结合能,计算结果显示范德华相互作用、静电相互作用和非极性溶剂化自由能是形成复合物的主要驱动力,通过对各个氨基酸残基的贡献研究发现,ASN-334、TRP-336、GLU-337、TYR-340、ASP-367、TRP-411、ASP-548、SER-576、ALA-577、PRO-579和ASP-606是对小分子棉籽糖与α-半乳糖苷酶的结合起关键作用的氨基酸残基。