研究背景:核酸纳米自组装是指通过设计特定的DNA序列而控制其形成各种纳米结构的新兴技术领域,具有可编程、智能化、无毒、无免疫源性、易被生物降解等特点,拥有较好的生物兼容性,在生物传感、生物荧光成像以及药物递送等领域拥有巨大的应用前景和潜在临床价值。因此,发展DNA纳米材料应用于生物医学领域已经成为目前临床和基础研究的重要方向之一。传统DNA纳米材料通常由镁离子介导自组装,但由于DNA纳米材料自身的高负电性、生理环境中的镁离子浓度不足以维持其结构稳定性、内源性清除系统及核酸酶的降解等因素,DNA纳米材料进入生物体后面临着稳定性低、细胞摄取效率低、组织靶向性不足等问题,亟需发展新的DNA组装策略以适应其在纳米生物学、纳米医学等方面的应用。内源性多胺是一类广泛存在于生物体中的氨基化合物,包括腐胺、亚精胺、精胺,三者间可相互转化,在细胞生长、组织再生、炎症修复等过程中发挥着重要的生物学调节作用。而多胺作为质子化、线性的有机生物分子,能在生理pH值下通过静电效应与DNA磷酸骨架相互作用,有效结合带负电荷的DNA,从而为DNA纳米材料自组装提供了新的策略与方法。内源性多胺携带多价正电荷及丰富的氨基基团,可能在实现DNA纳米材料自组装和功能化方面较传统镁离子具有更好的前景,而目前鲜见报道。本研究拟探讨内源性多胺介导DNA纳米材料自组装的可行性,对其细胞摄取效率、生理条件下稳定性及生物安全性进行评估,并对相关机制进行初步探究,旨在为DNA纳米材料的生物医学应用提供新的思路及实验基础。研究目的:1.探索内源性多胺介导DNA纳米材料自组装行为,多胺价态对组装行为的影响;2.探讨内源性多胺介导自组装DNA纳米材料的稳定性及其机制;3.探究内源性多胺的细胞毒性水平及其介导自组装的DNA纳米材料的细胞摄取效率及其生物医学的应用。研究方法:1.采用梯度退火法进行多胺介导的DNA纳米材料自组装,并用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native PAGE)对其结构完整性进行表征;2.模拟生理环境探究多胺介导自组装DNA纳米材料的稳定性;3.通过检测多胺介导自组装DNA纳米材料的圆二色谱(CD)以探究其优异稳定性机制;4.采用恒温自组装法进行多胺介导的DNA纳米材料自组装,并用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native PAGE)对其结构完整性进行表征;5.通过MTT法评估内源性多胺对肿瘤细胞的毒性水平;6.采用荧光酶标法及激光共聚焦法对多胺介导自组装DNA纳米材料的细胞摄取水平及其在细胞中的定位进行评估。研究结果:1.PAGE法验证内源性多胺介导DNA纳米材料自组装的可行性,腐胺、亚精胺、精胺均能成功介导DNA纳米材料自组装,其中腐胺和亚精胺具有很高的产率,而精胺所介导合成的纳米材料产率稍低。2.通过纯化洗涤等手段探究多胺介导DNA纳米材料在低离子浓度合成体系下的稳定性,结果显示其在多胺离子浓度较低的环境下均能保持结构稳定。但精胺介导合成的DNA纳米结构经超纯水洗涤后的产物较亚精胺和腐胺明显减少。3.37℃恒温PAGE电泳探究多胺介导DNA纳米材料的热稳定性结果显示,多胺及镁离子介导自组装的DNA纳米材料在37℃环境下均能保持其结构稳定性。4.模拟生理环境条件探究多胺介导DNA纳米材料的稳定性结果显示,腐胺介导自组装DNA四面体的血清稳定性优于镁离子组装DNA四面体,而精胺及亚精胺介导自组装DNA四面体的血清稳定性不及镁离子组装DNA结构。5.通过圆二色谱对多胺介导自组装DNA四面体的二级结构表征结果显示,亚精胺介导合成的DNA纳米管与镁离子介导合成的DNA纳米管在二级结构上有明显差异(从B螺旋向A螺旋偏移),但腐胺与精胺合成纳米材料与传统镁离子介导合成的DNA四面体的CD光谱未出现明显差别。6.PAGE法验证多胺介导DNA纳米材料进行恒温自组装的结果显示,腐胺、亚精胺、精胺均能成功介导DNA纳米材料的恒温自组装。7.MTT法检测内源性多胺的细胞毒性,腐胺、亚精胺、精胺在其介导DNA纳米材料自组装的最适浓度对H1299与A549两种常见肺癌肿瘤细胞均存在一定的毒性。8.荧光酶标板实验与激光共聚焦结果显示,H1299、MCF-7及A549三种常见肿瘤细胞对多胺介导合成DNA纳米材料的摄取明显优于传统镁离子合成的DNA纳米材料,其摄取效率趋势为:精胺>亚精胺>腐胺,且摄取后广泛分布于胞浆中。结论:1.内源性多胺可以作为新型合成介质介导DNA纳米材料的自组装,自组装产率和多胺的电荷数相关;多胺-DNA复合纳米材料细胞摄取效率及生理条件下稳定性明显优于传统镁离子合成的DNA纳米材料。2.多胺介导自组装DNA纳米材料高稳定性的机制可能是其与DNA结合力更强,且诱导DNA分子构象由B螺旋向A螺旋转变,此种转变可能与多胺分子本身氨基数目及DNA纳米结构的设计有关。3.内源性多胺能成功介导DNA纳米材料的恒温自组装,拓展了DNA纳米材料生物医学的应用范围;内源性多胺介导DNA纳米材料自组装的最适浓度对肿瘤细胞存在一定的毒性;肿瘤细胞对多胺介导合成DNA纳米材料的摄取明显优于传统DNA纳米材料,其被摄取后广泛分布于胞浆中。