论文部分内容阅读
禽网状内皮组织增生病（reticuloendotheliosis,RE）是由禽网状内皮组织增生病病毒（reticuloendotheliosis virus,REV）感染禽类宿主引起的一种病理综合征,包括生长迟缓,免疫抑制以及肿瘤发生等。由于REV传播途径多样,宿主范围广泛,因此自从1958年始,REV得以被广泛分布在全世界。此外,疫苗等生物制品也可能被REV污染,从而造成疫苗接种失败,抑制宿主免疫系统使其免疫力降低,导致其他疾病的共发,给畜牧养殖业经济造成巨大损失。本实验通过高通量测序、实时荧光定量PCR等方法手段,检测鸡胚成纤维细胞（CEF）在REV感染过程中可变剪接以及miRNA-155表达的变化,发掘二者在CEF应答REV感染的转录后水平上所发挥的调控作用,为进一步研究REV的免疫致病机制及其对感染动物免疫抑制以及肿瘤形成机制的探讨,提供新的研究方向,同时为该病的防制（治）提供理论依据和新思路。主要研究内容和结果如下:（1）荧光定量检测REV方法的建立将复制得到的病毒液提取RNA经PCR验证后,在紫外灯下可观察到195 bp长度的条带,证明病毒液为REV阳性。将复制成功的病毒液与质粒连接,并进行连续十倍稀释,通过荧光定量PCR得到REV LTR片段的扩增曲线、熔解曲线及标准曲线。各稀释度的重组质粒在达到对数增长期时间距均匀,证明其表达差异呈线性变化,同时阴性对照无扩增,证明本实验无假阳性干扰;扩增产物熔解峰单一,证明无引物二聚体和非特异性扩增,且熔解温度为85.252±0.057℃;REV LTR片段的标准曲线呈线性回归方程,所选取的各稀释度点均在线上,其回归方程为y=2.899x+4.464,相关系数R2=0.9991,证明可信度高。（2）病毒滴度测定于REV感染后第7 d记录细胞完全发生病变的孔数,经计算得到病毒液的TCID50为10-4.625/0.1ml,即将该病毒稀释104.625倍后接种100μl可使50%的细胞发生病变。（3）高通量测序结果及分析将CEFs分为对照组（C组）和病毒感染组（VB组）,每组均有3个重复,6个样本经高通量测序后均得到大量数据,长度为10.2 G-12.92 G,错误率为0.02%,Q20大于96%,Q30大于90%,GC含量在50%左右,去除其中影响分析结果的低质量及含有接头等的数据后,数据仍能达到原始数据的94.6%以上,说明测序数据质量较好。将处理后数据与参考基因组比对发现,70%以上可比对到参考基因组序列上,其中能唯一比对到参考基因组序列上的数据大于90%,说明样品未被污染,且选择的参考基因组是合适的。同时还发现,可比对到参考基因组序列的蛋白编码区域,即外显子的百分比均大于70%,说明检测到的基因绝大多数都是编码蛋白质的基因,也证明了测序的序列都来自于m RNA。在两个比较组中,共发现15973个基因,其中6 939个基因发生了可变剪接,外显子跳跃（SE）事件发生数量为16 860,占总事件数量89.22%,是最普遍的一种剪接模式,也是产生差异最主要的可变剪接模式,上调事件为183,下调事件为524。在C组和VB组间共发现5 607个基因显著差异表达,2 825个基因在REV感染组的表达显著高于对照组,2 782个基因在REV感染组的表达显著低于对照组。差异表达可变剪接基因主要与GO富集分析中的细胞组成相关,如细胞器管腔、膜结合细胞器、细胞质与囊泡等。差异表达可变剪接基因富集较多的KEGG细胞信号转导通路为磷脂酰肌醇信号通路、MAPK信号通路、凋亡、焦点粘连等。（4）高通量测序结果验证随机选择FN1、TNC和SEC61B被剪接的外显子,分别命名为Fe、Te和Se,作为对照,这3个外显子临近未被剪接的外显子同样被检测,依次命名为Fn、Tn和Sn。Fe、Te和Se的泳道没有或仅有少量PCR产物,其余泳道均有明显且长度正确的条带,说明高通量测序预测的可变剪接事件是真实发生的。（5）miR-155表达与REV接毒时间和剂量的关系与C组相比较,VB组接毒后12、24、48、72、96和120 h的miR-155表达量显著上升（P<0.01）,并随病毒作用时间的延长而升高,且二者呈正相关,并于接毒后第72 h达到峰值（P<0.001）。另外,随着REV感染滴度的增加,miR-155表达量也随之升高（P<0.001）,二者呈正相关。（6）miR-155 NC、mimics和inhibitors转染效率检测在荧光倒置显微镜下观察发现,未转染的正常CEFs中未见荧光,而分别转染了miR-155NC,mimics和inhibitors的CEFs胞质中均出现了程度不同的荧光,且荧光效率可达60%以上。经荧光定量PCR检测,转染miR-155 mimics的CEFs中miR-155表达量显著升高（P<0.001）,并随转染时间的延长逐渐增强,转染后第72 h达到较高水平并基本维持不变;转染miR-155 inhibitors的CEFs中miR-155表达量显著降低（P<0.01）,在转染后第12 h即被完全被抑制,并且在转染后72 h内miR-155表达量均保持在较低水平;转染miR-155 NC的CEFs中,miR-155表达量与未经转染的CEFs之间无显著性差异（P>0.05）。（7）REV感染对CEFs活力的影响将CEFs分别分为:C（对照组）、V（只接毒不转染）、VN（接毒后转染miR-155 NC）、VM（接毒后转染miR-155 mimics）和VI（接毒后转染miR-155 inhibitors）组。与C组相比,V组CEFs活力极显著（P<0.001）降低。与V组相比,VM组细胞活力极显著（P<0.001）提高,而VI组细胞活力极显著（P<0.01）降低,VN组与V组间细胞活力无显著性（P>0.05）差异。（8）REV感染对CEFs凋亡及其相关酶活性的影响流式细胞仪检测结果显示,与C组相比,V组凋亡细胞数量极显著（P<0.01）增加。与V组相比,VM细胞凋亡率显著（P<0.05）降低,VI组显著（P<0.05）的增加了CEFs的凋亡率,VN组与V组间细胞凋亡率无显著性（P>0.05）差异。Caspase-3活性检测结果显示,与C组相比,V组中ρNA产量显著（P<0.05）提高。与V组相比,VM组降低ρNA产量,VI组极显著（P<0.01）提高ρNA产量,VN组与V组间ρNA产量未见显著性（P>0.05）差异。（9）REV感染对CEFs细胞周期的影响流式细胞仪检测结果显示,与C组相比,V组CEFs的G0/G1期细胞数量极显著（P<0.01）提高,而S期和G2期细胞极显著（P<0.01）或显著（P<0.05）减少。与V组相比,VM组CEFs的G0/G1期细胞数量极显著（P<0.01）减少,而S期细胞极显著（P<0.01）增加,G2期细胞数量有所增加;VI组CEFs的G0/G1期细胞数量极显著（P<0.01）增加,G2期细胞数量显著（P<0.05）减少,S期细胞相对减少。而VN组与V组间各细胞周期分布无显著性（P>0.05）差异。（10）miR-155靶基因验证经Targetscan、miRanda软件以及高通量测序结果分析发现,caspase-6和FOXO3a是数据库中共同命中的miR-155靶基因。Western Blot（WB）检测结果显示,与C组相比,V组caspase-6和FOXO3a蛋白表达量显著（P<0.05）升高。与V组相比,VM组caspase-6和FOXO3a蛋白表达量显著（P<0.05）降低;VI组FOXO3a蛋白表达量进一步显著（P<0.05）升高,caspase-6蛋白表达量也有所升高。VN组与V组的caspase-6和FOXO3a蛋白表达量未见统计学差异（P>0.05）。上述研究结果为进一步阐明REV感染对CEFs转录后调控的影响,及可变剪接和miR-155在其中所扮演的重要角色提供了重要的科学实验依据,也为进一步在分子水平探讨REV的免疫致病机制提供了新思路。