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药物代谢研究是新药开发和研究中的关键环节,对代谢产物及其代谢过程进行深入分析可以明确药物发挥药效和引起毒性的机制,从而确保药物的安全性,为药物临床应用提供科学依据。传统中药千金子（Euphorbiae semen）,来自大戟科植物续随子Euphorbia lathyris Linnaeus的干燥成熟种子,根据《中国药典》（2020版一部）记载,千金子有毒,功效有“逐水消肿,破血消癥”,主治“水肿,痰饮,积滞胀满,二便不通,血瘀经闭”。然而在《中华本草》中注明:千金子对胃肠黏膜有刺激作用,对中枢神经系统也有毒性作用。通过文献调研,表明千金子的主要毒效成分为二萜类化合物,但目前关于千金子二萜类成分的代谢仍然缺乏研究,为千金子这一有毒中药的临床安全使用带来了困难。因此,本课题以千金子质量控制指标性成分千金子甾醇和巨大戟烷代表性成分巨大戟醇为研究对象,开展了全面的体内外代谢研究,探讨了其潜在的代谢机制,并通过体外细胞实验对千金子甾醇和巨大戟醇原型及其代谢产物的活性和潜在毒性进行研究,为千金子安全、合理、可控的临床应用提供数据支持与参考。1、基于超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱联用（Ultra-performance liquid chromatography coupled with quadrupole time-of-flight mass spectrometry,UPLC-Q/TOFMS）技术,结合UNIFI数据处理系统,建立了千金子甾醇和巨大戟醇代谢产物的快速、高效的定性分析方法。通过体内外代谢实验,最终鉴定了千金子甾醇代谢产物31个,巨大戟醇代谢产物18个。此外,通过预实验发现雅致小克银汉霉（Cunninghamella elegans）微生物转化模型能够模拟千金子甾醇和巨大戟醇体内代谢过程。2、根据上述研究提供的线索,利用大规模微生物转化实验和化学水解实验制备了代谢产物,基于一维和二维核磁共振技术（One-and two-dimensional nuclear magnetic resonance,1D和2D NMR）的结构鉴定,并与体内代谢产物的质谱信息和保留时间进行比较,首次确证了12个千金子甾醇代谢产物和3个巨大戟醇代谢产物的准确结构。进一步分析代谢产物类型和代谢途径发现,千金子甾醇的I相代谢反应主要涉及羟基化、水解和氧化反应,Ⅱ相代谢以磺酸化和葡萄糖苷化为主;巨大戟醇的I相代谢主要涉及羟基化和氧化,Ⅱ相代谢以磺酸化和葡萄糖醛酸化为主。3、基于体外代谢稳定性实验和细胞色素P450（Cytochrome P450,CYP450）酶代谢表型实验,推断千金子甾醇代谢部位主要涉及肝脏、肠和胃,CYP3A4、CYP2E1和CYP2A6是参与千金子甾醇代谢的最主要的亚型酶;巨大戟醇代谢部位主要涉及肝脏和胃,证实CYP2A6和CYP3A4参与了巨大戟醇的代谢。通过大鼠体内药代动力学实验（口服给药100 mg/kg）,得出千金子甾醇血药浓度极大值(Cmax)平均为300.60ng/m L,给药达峰时间(Tmax)平均为6.00 h;巨大戟醇血药浓度Cmax平均为3269.10ng/m L,Tmax平均为0.49 h。这些结果为千金子甾醇和巨大戟醇体内代谢机制的进一步研究奠定了基础。4、利用脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）诱导的RAW264.7炎症模型和糖氧剥夺/复氧（Oxygen-glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R）损伤PC12细胞模型分别考察千金子甾醇和巨大戟醇代谢的生物活性;以4株人源细胞模型考察千金子甾醇和巨大戟醇的细胞毒性。结果表明,千金子甾醇代谢产物Q3（20-hydroxyl euphorbiasteroid）、Q24（epoxylathyrol）和Q25（15-deacetyl euphorbiasteroid）对人心肌细胞AC-16和人肾小管上皮细胞HK-2的细胞毒作用显著,其中Q3对细胞AC-16和HK-2的IC50值分别为17.86±0.19μM和22.65±0.25μM,Q25对细胞AC-16和HK-2的IC50值分别为3.60±0.04μM和16.11±0.18μM;相比于原型巨大戟醇,其代谢产物对四株细胞的毒性较小。在体外抗炎实验中,发现代谢产物Q24和Q25对LPS诱导的RAW 264.7细胞释放NO有一定的抑制效果,IC50分别为23.15±2.31μM和19.39±1.59μM。在体外神经保护实验中,发现巨大戟醇丙叉化产物（J-4和J-5）和代谢产物M4（19-hydroxyl ingenol）对OGD/R损伤的PC12细胞均有保护作用。以上结果表明,千金子甾醇代谢产物Q3、Q24和Q25可能具有潜在的毒性作用,巨大戟醇代谢产物M4可能具有一定的神经细胞保护作用。综上所述,本课题建立了千金子甾醇和巨大戟醇基于UPLC-Q/TOF-MS的快速有效的分析方法,完成千金子甾醇和巨大戟醇体内外代谢的定性表征;并且结合微生物转化和化学水解方法,制备了千金子甾醇和巨大戟醇代谢产物,进一步明确了代谢产物的准确结构和代谢途径;初步探讨了千金子甾醇和巨大戟醇的代谢机制;研究了千金子甾醇和巨大戟醇及其代谢产物基于细胞模型的毒性和生物活性,为进一步明确千金子药材的体内效应物质基础提供了较好的数据支持。