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目的研究p27kip1发生O-GlcNAc修饰后对磷酸化水平及磷酸化信号转导途径的影响,进一步分析p27kip1的O-GlcNAc修饰对人类原发性肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma,HCC）的增殖和恶变的影响。方法1.通过免疫共沉淀及O-GlcNAc抗体在工具细胞（HEK293T）及肝癌细胞系（HepG2、Huh7）检测p27kip1是否存在O-GlcNAc糖基化修饰。然后,分别运用高糖DMEM液（含25 mM葡萄糖）、低糖DMEM液（含5 m M葡萄糖）、OGA抑制剂（O-连接的β-N-乙酰葡萄糖苷酶抑制剂）处理细胞24小时,免疫印迹方法检测全细胞蛋白及p27kip1的糖基化修饰水平变化。将OGA-shRNA质粒转染肝癌细胞下调OGA的表达,免疫印迹方法检测全细胞蛋白及p27kip1的糖基化修饰水平变化。2.选取p27kip1 O-GlcNAc糖基化高表达的HepG2细胞株进行以下实验。PUGNAc处理后运用免疫共沉淀方法检测p27kip1 O-GlcNAc糖基化对p27kip1 Ser10及Thr187磷酸化水平的影响。利用质朴分析方法预测p27kip1的糖基化修饰位点,在此基础上构建点突变载体,转染HepG2细胞后进一步验证p27kip1的糖基化位点。3.将p27kip1和糖基化及磷酸化位点突变质粒分别转染HepG2细胞,建立血清饥饿释放模型,免疫荧光及免疫印迹分析p27kip1亚细胞定位的变化。最后,免疫共沉淀方法分析p27kip1糖基化对p27kip1/CRM1相互作用的影响。4.p27kip1糖基化位点突变后,免疫共沉淀方法检测p27kip1对cycline/cdk2复合体的结合能力。利用流式细胞术及cck8试剂盒研究p27kip1糖基化对细胞增殖的影响。此外,收集4对hcc的癌与癌旁新鲜标本,免疫印迹检测p27kip1糖基化修饰的变化。运用免疫组化方法分别检测了96例hcc标本中p27kip1和ogt的表达水平,分析其与hcc患者的年龄、性别、肿瘤组织学分级、肿瘤体积大小等临床病理因素之间的相关性。通过kaplan-meier法分析p27kip1及ogt的表达情况与患者预后的关系。结果1.p27kip1在hek293t及hepg2、huh7细胞株中存在o-glcnac修饰;在pugnac及高糖刺激下,全细胞蛋白及p27kip1的糖基化水平升高。oga表达的下调可引起全细胞蛋白及p27kip1的糖基化水平升高。2.pugnac处理hepg2细胞,随着p27kip1的糖基化水平增高,p27kip1ser10磷酸化水平亦增高。此外,我们发现2、106、110、157、198号位的丝氨酸/苏氨酸为其糖基化位点。进一步的研究发现ser2糖基化位点突变显著降低ser10磷酸化水平。3.血清饥饿释放实验模型中,p27kip1蛋白随着细胞周期的进展由细胞核向胞浆转位。此外,p27kip1ser2突变载体(p27kip1-s2a)与野生型相比,抑制了p27kip1的出核与胞浆定位,并且p27kip1-s2a与crm1相互作用减弱。4.p27kip1ser2糖基化突变体与野生型相比,其对cycline/cdk2复合物的结合及抑制作用增强。当p27kip1发生糖基化修饰后,hepg2细胞增殖能力明显增强。hcc组织中的p27kip1o-glcnac修饰水平显著高于对应的癌旁肝组织;ogt的表达强度与肝细胞肝癌组织分化程度（p<0.05）、ki-67的表达水平（p<0.05）有统计学意义;p27kip1的亚细胞定位与肝细胞肝癌组织分化程度（p<0.05）、肿瘤大小（p<0.05）、ki-67的表达水平（p<0.05）有统计学意义;kaplan-meier分析显示ogt在肝细胞肝癌中的高表达及p27kip1的胞浆定位与患者总生存率的降低显著相关（p<0.001）。结论1.p27kip1具有o-glcnac修饰,且p27kip1ser2糖基化水平参与调节其Ser10磷酸化水平,进一步影响Ser10磷酸化信号转导途径。2.糖基化水平促进p27kip1的细胞浆定位,解除p27kip1对细胞核内CyclinE/CDK2复合物的抑制作用,促进HCC细胞增殖;p27kip1O-GlcNAc修饰参与调控HCC的发生发展,可能为HCC的治疗提供了一个潜在的靶点。