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鸡传染性支气管炎(Avian Infectious Bronchitis,IB)是由鸡传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus,IBV)引起的鸡的一种急性、高度接触性传染病。IB可感染所有日龄的鸡并且还常常引起支原体混合感染以及大肠杆菌等继发感染从而增加鸡群的死亡率,给养鸡业生产带来巨大的损失。目前,该病呈世界性流行,是严重危害世界养禽业的重要传染病之一。IBV基因组容易发生变异导致其血清型众多,不同血清型之间交叉保护力弱,给本病防治带来很大的困难。因此探索快速、灵敏、特异的抗体检测和病原诊断方法已成为当前迫切需要解决的难题。当前IBV抗体血清学检测方法中,ELISA因具有快速、简便、准确、特异的特点被广泛采用并已被国际兽疫局(OIE)确定为标准方法。当前商品化的IBV抗体检测试剂盒大多采用全病毒粒子包被,对不同血清型的地方毒株的交叉反应性差异较大,加上活病毒纯化困难且存在散播病毒的危险性及检测成本高,使得商品化IBV抗体检测试剂盒的应用受到限制。IBV传统的病原诊断方法虽然准确,但操作复杂、耗时、费力,其它的核酸诊断方法如核酸探针杂交、RT-PCR、实时荧光定量RT-PCR方法灵敏、特异,但分别存在耗时、致癌物质EB的污染、需要昂贵的仪器和试剂的不足之处,不适于基层快速检测需要。因此,研究利用序列相对保守且具有强免疫保护性的IBV N基因重组蛋白作为包被抗原的ELISA诊断试剂盒和建立快速、操作简便的IBV检测方法十分重要。首先,本研究在本课题组建立的间接N-ELISA的基础上进行试剂盒的研制,即进行批内和批间重复性试验、37℃加速老化试验、4℃和-20℃保存期试验对比、符合性试验和阻断试验。结果表明,批内重复性试验变异系数为3.07%～8.34%,批间重复性系数为2.33%～6.36%,均小于10%,说明该试剂盒具有良好的重复性;4C和-20℃保存期试验表明该试剂盒的最佳保存条件为-20℃;37℃加速老化试验结果表明试剂盒在4℃可稳定保存7～8个月,二抗在4℃可稳定保存一年左右;应用研制的试剂盒和IDEXX公司的商品化试剂盒同时检测296份血清样品,结果该试剂盒阴性符合率为86.39%,阳性符合率为97.3%,说明本试剂盒具有很好的符合性。应用研制的IBV间接N-ELISA试剂盒对来自广西A、B、C、D、E五个公司的1368份血清样品进行检测,结果表明该试剂盒检测结果能够很好的反映免疫效果;应用保存期为2、4、6个月的试剂盒分别检测来自临床的540份血清,结果表明随着时间的推移,被检测样品抗体水平除了稍下降外,吻合性非常好。其次,本研究根据IBV的N基因序列设计了一套环介导等温扩增(LAMP)引物,建立了反转录环介导等温扩增(RT-LAMP)快速检测IBV的方法,敏感性试验表明该方法的检测限为900fg以下;特异性试验表明该方法具有良好的特异性;批间和批内重复性试验表明本方法具有良好的重复性;该方法对临床病料的检测结果与常规RT-PCR结果符合。全程只需要一台水浴锅,一个小时即可完成全部反应。因此,本研究建立的RT-LAMP方法特异、重复性好、不需特殊仪器、简便、快速,适用于IBV的快速检测,值得在基层业务部门及养殖场推广。因此,本研究研制了特异、敏感、安全、稳定且廉价的IBV间接N-EILSA试剂盒和特异、敏感、重复性好、不需特殊仪器、简便、快速的反转录RT-LAMP检测方法。本研究具有非常重要的应用价值。