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转录因子DNA结合谱是指转录因子能够特异性识别并结合的所有DNA序列及其相对亲合性。目前构建转录因子DNA体外结合谱主要依赖于蛋白结合微阵列(PBM)技术和指数配体进化-测序(SELEX-Seq)技术。其中,SELEX-Seq技术将SELEX实验与高通量测序技术相结合,可获得大量具有不同亲和性的转录因子DNA结合序列。高通量测序结果的数据量大,数据处理过程繁琐,对传统生物实验室产生一定的挑战,因此有必要建立一套通用的SELEX-Seq数据分析流程,使研究者依照流程快速地分析该类数据,构建转录因子DNA体外结合谱。 核因子κB(NF-κB)是与炎症和肿瘤有关的重要转录因子,它的5个家族成员通过二聚化形成二聚体后与不同的DNA序列结合,调控基因的转录,因此NF-κB的DNA结合谱研究一直深受重视。受制于DNA结合谱构建技术的发展水平和NF-κB二聚体的多样性,完整的高分辨率NF-κB DNA结合谱至今尚未建立。但是研究者已经使用不同的方法得到部分NF-κB二聚体与DNA序列的结合亲和性数据,将这些数据进行汇总处理,可得到较为全面的NF-κB DNA结合谱。 本论文通过分析实验室已有的SELEX-Seq数据,建立一套通用的SELEX-Seq数据分析流程,主要包括以下步骤: (1)测序数据初始分析; (2)根据标签序列分轮,获取各轮经过筛选的序列; (3)从长序列中提取转录因子结合位点长度的短序列; (4)模体发现:首先使用模体发现软件发现各轮序列模体,从模体总体特征分析序列富集特征及效果,之后计算模体富集倍数,获取中间模体,最后将中间模体序列提交给模体发现软件,获得最终模体; (5)计算序列富集倍数:首先使用马尔科夫模型预测未筛选样品中所有序列的出现频数,以此计算各序列在每轮筛选后的富集倍数,获取转录因子对各序列的相对结合亲和性信息,最终以转录因子结合的序列信息及其相对结合亲和性信息构成转录因子的DNA体外结合谱。通过该数据分析流程获得p50同二聚体的DNA结合谱。 本论文收集近几年研究者使用凝胶迁移实验技术(EMSA)、PBM及SELEX-Seq技术测量NF-κB二聚体与DNA序列的结合亲和性数据,并进行归一化、拟合处理,构建完整的NF-κB家族DNA结合谱。结合谱数据存储于数据库中,依托已有的网络平台为用户提供DNA序列亲和性的查询功能。 通过对NF-κB DNA结合谱数据分析发现: (1) NF-κB二聚体结合DNA序列特征可分为三类,即RelA/c-Rel、p50/p52同二聚体以及各异二聚体; (2)各二聚体结合的高亲和性DNA序列具有相似特征,而二聚体对低亲和性序列的结合具有偏好性; (3)组成异二聚体的两个单体在二聚体与DNA序列的识别和结合过程中发挥的作用并不完全相同。 综上所述,本论文建立的SELEX-Seq数据分析流程,可用于其他转录因子的SELEX-Seq数据分析,方便研究者快速地建立转录因子DNA体外结合谱。通过数据收集、汇总和处理得到的NF-κB DNA结合谱一方面提供了DNA结合序列亲和性的查询平台,另一方面为在全基因组水平上预测NF-κB的DNA靶点和靶基因,进而构建转录调控网络提供数据参考。