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目的:1、研究病理标本中ECT2的表达情况,并探讨其与喉鳞癌临床病理特征间的关系。2、研究体外环境下ECT2在喉鳞癌Hep-2细胞中mRNA及蛋白的表达情况,研究体外环境下通过siRNA干扰下调ECT2表达后对喉鳞癌Hep-2细胞周期的影响以及对细胞凋亡、增殖、转移、侵袭的作用,并探讨其中的分子机制。3、研究通过慢病毒介导ECT2shRNA在喉鳞癌Hep-2中干扰下调ECT2表达后对细胞体外克隆形成能力的影响。4、研究在体内环境下慢病毒介导的ECT2shRNA在喉癌Hep-2细胞中干扰下调ECT2表达后对体内肿瘤生长的影响及机制探讨。方法:1、回顾性研究2013年9月~2015年3月在我院首次治疗的喉鳞癌患者,所有患者临床病理资料完整,并经病理科确诊。取81例喉鳞状细胞癌组织石蜡切片标本,同时选取81例癌旁组织石蜡切片标本做对照,运用免疫组化法检测ECT2抗原表达情况,并与临床病理资料进行统计,了解ECT2与喉癌临床病理特征的关系。2、运用免疫印迹(western blot)法和实时荧光定量PCR(QPCR)法检测ECT2 siRNA干扰下调对Hep-2细胞ECT2表达的影响。3、运用CCK-8法检测ECT2 siRNA下调ECT2后对Hep-2细胞增殖的影响。4、通过流式细胞仪检测ECT2siRNA下调ECT2对Hep-2细胞周期的影响。采取Western blot和实时荧光定量PCR法检测ECT2siRNA下调ECT2后对Cip/Kip家族中的细胞周期蛋白p27、cyclinD1、cyclinE的表达水平的影响。5、运用流式Annexin V-FITC/PI双染法检测ECT2 siRNA下调ECT2对Hep-2细胞凋亡的影响。运用Western blot法检测下调ECT2后对凋亡蛋白cleaved capase-3表达水平的影响。6、运用侵袭实验和迁移实验检测ECT2siRNA在喉癌Hep-2细胞中下调ECT2后对细胞侵袭、迁移能力的影响。运用QPCR和Western blot法检测下调ECT2后对侵袭转移相关蛋白RhoA,Cdc42,Racl表达水平的影响。7、通过慢病毒shRNA侵染Hep-2细胞,构建稳定转染的ECT2shRNAHep-2细胞株。采用软琼脂克隆形成实验测shRNA下调ECT2后对Hep-2细胞体外克隆形成能力的影响。构建裸鼠移植瘤模型观察shRNA下调ECT2对Hep-2细胞在裸鼠皮下移植瘤生长的影响,运用Western blot法检测通过ECT2shRNA下调后,ECT2在裸鼠肿瘤内的表达情况,运用免疫组化法检测验证与增殖相关ki67在肿瘤组织中的表达情况。结果:1、通过统计分析提示喉癌肿瘤组织比癌旁组织ECT2表达高(P<0.01),喉癌病理组织分化程度越低组ECT2表达越高,喉癌中临床分期及T分期越高组ECT2表达越高,喉癌中有淋巴结转移组比无淋巴结转移组ECT2表达高(P<0.05);ECT2的高表达与患者年龄、性别、吸烟史,及肿瘤部位无明显关系(P>0.05)。2、小干扰ECT2siRNA作用Hep-2细胞后,Hep-2细胞中ECT2的mRNA和蛋白表达水平明显降低。3、小干扰ECT2siRNA通过下调ECT2表达抑制了 Hep-2细胞增殖。4、小干扰ECT2siRNA通过下调ECT2表达抑制了 Hep-2细胞分裂,将细胞周期阻滞于G1期,与细胞周期调控相关的Cip/Kip家族中的蛋白cyclinD1和cyclinE的表达下调,P27的表达上调。5、小干扰ECT2siRNA通过下调ECT2促进了 Hep-2细胞凋亡,与凋亡相关的cleaved caspase-3蛋白的表达上调。6、小干扰ECT2siRNA通过下调ECT2抑制了 Hep-2细胞侵袭和迁移能力,与侵袭转移相关蛋白Cdc42,Rac1的表达下调。7、构建慢病毒介导的稳定转染ECT2shRNAHep-2细胞株。ECT2shRNA干扰下调ECT2表达抑制Hep-2细胞体外克隆球形成能力,并且抑制了 Hep-2细胞在裸鼠皮下移植瘤的生长能力,同时通过免疫组化检测到细胞增殖标记物ki67表达下调。结论:1、ECT2在喉癌组织中高表达,与患者病理分化程度,T分期,临床分期,淋巴结转移相关,差异具有统计学意义,与年龄、吸烟史、性别、肿瘤部位无关。2、小干扰RNA下调ECT2可阻滞Hep-2细胞周期于G1期,可能是通过抑制Cip/Kip家族的cyclinD1、cyclinE的表达,促进p27的表达来实现。3、小干扰RNA下调ECT2促进Hep-2细胞凋亡,可能是通过促进cleaved caspase-3的表达来实现。4、小干扰RNA下调ECT2抑制Hep-2细胞迁移和侵袭,可能是通过抑制CDC42,RAC1来实现。5、慢病毒RNA干扰下调ECT2可抑制喉癌细胞体外克隆形成能力及体内生长能力,增殖相关因子Ki67的表达下调可能参与其中的机制。