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目的
1.了解温州医科大学附属第一医院2015年1月~5月间临床分离的肺炎克雷伯菌对临床常用抗菌药物的耐药情况,并检测菌株对氯己定的耐药性,为临床有效控制肺炎克雷伯菌感染和合理使用氯己定消毒剂提供理论依据.
2.研究肺炎克雷伯菌对氯己定产生耐药的可能机制及分子流行病学,为有效预防氯己定耐药肺炎克雷伯菌的出现提供理论依据.
3.研究诱导氯己定耐药肺炎克雷伯耐药菌株对临床常用药物的敏感性改变,并探究其与抗菌药物交叉耐药的机制.
方法
1.收集温州医科大学附属第一医院2015年1月~5月间临床分离肺炎克雷伯菌株并对菌株临床资料进行回顾性调查;分析其标本来源并对临床常用抗菌药物的敏感性应用Vitek(R)2Compact全自动微生物分析仪进行检测;通过琼脂稀释法检测肺炎克雷伯菌对氯己定的最低抑菌浓度(MIC).
2.对25株氯己定耐药肺炎克雷伯菌进行外排泵抑制试验.在加或不加外排泵抑制剂羰酰氰间氯苯腙(carbonylcyanidemchlorophenylhydrazone,CCCP,10μg/ml)情况下,采用琼脂稀释法检测菌株对氯己定MIC值的变化.若在加入CCCP后菌株的氯己定MIC值降低≥4倍,则判定外排泵抑制剂CCCP有抑制作用,外排泵表型试验阳性;采用PCR方法检测外排泵基因cepA、qacE、qacΔE1.
3.采用RT-qPCR法检测其中6株氯己定耐药菌株(4株同时携带cepA、qacE和qacΔE1,2株仅携带cepA基因)外排泵基因cepA、qacE、qacΔE1的表达情况.
4.通过多位点序列分型(MLST)和脉冲场凝胶电泳(PFGE)对25株氯己定耐药肺炎克雷伯菌进行分型.
5.选取同时期分离的3株常用抗菌药物及消毒剂敏感的肺炎克雷伯菌(FK1891、FK2114、FK2138),通过体外多步诱导氯己定耐药,并检测其稳定性;应用琼脂稀释法检测诱导前后菌株对临床常用药物的敏感性变化;对3株氯己定诱导后产生的黏菌素(Colistin)耐药株进行黏菌素耐药基因pmrA、pmrB、phoP、phoQ和mgrB基因的突变情况检测.
结果
1.2015年1月~5月间临床分离的332株肺炎克雷伯菌主要来源于痰液标本(44.6%,148/332),其次为血液(16.0%,53/332)、脓液(10.2%,34/332)、尿液(9.3%,31/332)、创面(5.1%,17/332)、引流液(5.1%,17/332)以及其他标本包括导管、敷料和脑脊液等(9.6%,32/332).332株肺炎克雷伯菌分离株均对氨苄西林耐药,对呋喃妥因耐药率较高,对其他抗菌药物尤其是头孢替坦、阿米卡星、复方新诺明、亚胺培南、哌拉西林/他唑巴坦、妥布霉素、厄他培南的非敏感率较低,对氯己定的敏感性较好,共检出25株耐药菌株,耐药率为7.5%.
2.25株氯己定耐药肺炎克雷伯菌在加入外排泵抑制剂CCCP(10μg/ml)前后的氯己定MIC值均降低4倍以上.氯己定抗性基因cepA、qacE和qacΔE1的携带率分别为100%(25/25)、40%(10/25)和40%(10/25),其中10株氯己定耐药菌株同时携带上述三种外排泵基因.
3.6株氯己定耐药菌株的抗性基因表达量均不同程度高于非耐药对照菌株肺炎克雷伯菌ATCC700603.
4.MLST和PFGE结果显示,25株氯己定耐药菌株分别属于19种ST型和各种不同脉冲型.
5.3株肺炎克雷伯菌株(FK1891、FK2114和FK2138)在经过氯己定诱导后,黏菌素的MIC值均从0.25μg/ml增加至32μg/ml,对其他抗菌药物的敏感性无明显变化.PCR结果显示,FK1891、FK2114和FK2138经诱导后,均发生了PmrB氨基酸突变,3株菌都存在L82R和R256G突变,此外,FK1891诱导菌株还存在L344P突变.而pmrA、phoP、phoQ和mgrB基因均未发生改变.
结论
1.本院分离的332株肺炎克雷伯菌主要来源于痰液标本,对临床常见的抗菌药物表现出不同程度的耐药,对氯己定消毒剂的敏感性较好,共筛出25株氯己定耐药肺炎克雷伯菌.
2.本研究发现肺炎克雷伯菌对氯己定的耐药性与cepA、qacE和qacΔE1外排泵基因的高表达密切相关.
3.25株氯己定耐药肺炎克雷伯菌株间的同源性较低,不存在克隆传播和暴发流行现象.
4.本研究发现体外诱导氯己定耐药菌株的黏菌素MIC值明显升高,提示存在交叉耐药性,其耐药机制可能与PmrB氨基酸突变有关.
1.了解温州医科大学附属第一医院2015年1月~5月间临床分离的肺炎克雷伯菌对临床常用抗菌药物的耐药情况,并检测菌株对氯己定的耐药性,为临床有效控制肺炎克雷伯菌感染和合理使用氯己定消毒剂提供理论依据.
2.研究肺炎克雷伯菌对氯己定产生耐药的可能机制及分子流行病学,为有效预防氯己定耐药肺炎克雷伯菌的出现提供理论依据.
3.研究诱导氯己定耐药肺炎克雷伯耐药菌株对临床常用药物的敏感性改变,并探究其与抗菌药物交叉耐药的机制.
方法
1.收集温州医科大学附属第一医院2015年1月~5月间临床分离肺炎克雷伯菌株并对菌株临床资料进行回顾性调查;分析其标本来源并对临床常用抗菌药物的敏感性应用Vitek(R)2Compact全自动微生物分析仪进行检测;通过琼脂稀释法检测肺炎克雷伯菌对氯己定的最低抑菌浓度(MIC).
2.对25株氯己定耐药肺炎克雷伯菌进行外排泵抑制试验.在加或不加外排泵抑制剂羰酰氰间氯苯腙(carbonylcyanidemchlorophenylhydrazone,CCCP,10μg/ml)情况下,采用琼脂稀释法检测菌株对氯己定MIC值的变化.若在加入CCCP后菌株的氯己定MIC值降低≥4倍,则判定外排泵抑制剂CCCP有抑制作用,外排泵表型试验阳性;采用PCR方法检测外排泵基因cepA、qacE、qacΔE1.
3.采用RT-qPCR法检测其中6株氯己定耐药菌株(4株同时携带cepA、qacE和qacΔE1,2株仅携带cepA基因)外排泵基因cepA、qacE、qacΔE1的表达情况.
4.通过多位点序列分型(MLST)和脉冲场凝胶电泳(PFGE)对25株氯己定耐药肺炎克雷伯菌进行分型.
5.选取同时期分离的3株常用抗菌药物及消毒剂敏感的肺炎克雷伯菌(FK1891、FK2114、FK2138),通过体外多步诱导氯己定耐药,并检测其稳定性;应用琼脂稀释法检测诱导前后菌株对临床常用药物的敏感性变化;对3株氯己定诱导后产生的黏菌素(Colistin)耐药株进行黏菌素耐药基因pmrA、pmrB、phoP、phoQ和mgrB基因的突变情况检测.
结果
1.2015年1月~5月间临床分离的332株肺炎克雷伯菌主要来源于痰液标本(44.6%,148/332),其次为血液(16.0%,53/332)、脓液(10.2%,34/332)、尿液(9.3%,31/332)、创面(5.1%,17/332)、引流液(5.1%,17/332)以及其他标本包括导管、敷料和脑脊液等(9.6%,32/332).332株肺炎克雷伯菌分离株均对氨苄西林耐药,对呋喃妥因耐药率较高,对其他抗菌药物尤其是头孢替坦、阿米卡星、复方新诺明、亚胺培南、哌拉西林/他唑巴坦、妥布霉素、厄他培南的非敏感率较低,对氯己定的敏感性较好,共检出25株耐药菌株,耐药率为7.5%.
2.25株氯己定耐药肺炎克雷伯菌在加入外排泵抑制剂CCCP(10μg/ml)前后的氯己定MIC值均降低4倍以上.氯己定抗性基因cepA、qacE和qacΔE1的携带率分别为100%(25/25)、40%(10/25)和40%(10/25),其中10株氯己定耐药菌株同时携带上述三种外排泵基因.
3.6株氯己定耐药菌株的抗性基因表达量均不同程度高于非耐药对照菌株肺炎克雷伯菌ATCC700603.
4.MLST和PFGE结果显示,25株氯己定耐药菌株分别属于19种ST型和各种不同脉冲型.
5.3株肺炎克雷伯菌株(FK1891、FK2114和FK2138)在经过氯己定诱导后,黏菌素的MIC值均从0.25μg/ml增加至32μg/ml,对其他抗菌药物的敏感性无明显变化.PCR结果显示,FK1891、FK2114和FK2138经诱导后,均发生了PmrB氨基酸突变,3株菌都存在L82R和R256G突变,此外,FK1891诱导菌株还存在L344P突变.而pmrA、phoP、phoQ和mgrB基因均未发生改变.
结论
1.本院分离的332株肺炎克雷伯菌主要来源于痰液标本,对临床常见的抗菌药物表现出不同程度的耐药,对氯己定消毒剂的敏感性较好,共筛出25株氯己定耐药肺炎克雷伯菌.
2.本研究发现肺炎克雷伯菌对氯己定的耐药性与cepA、qacE和qacΔE1外排泵基因的高表达密切相关.
3.25株氯己定耐药肺炎克雷伯菌株间的同源性较低,不存在克隆传播和暴发流行现象.
4.本研究发现体外诱导氯己定耐药菌株的黏菌素MIC值明显升高,提示存在交叉耐药性,其耐药机制可能与PmrB氨基酸突变有关.