【摘 要】
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J亚群禽白血病病毒（ALV-J）是一种能够诱发鸡髓细胞性白血病的病毒,它能造成鸡群免疫抑制、引起继发感染甚至肿瘤性死亡。自发现以来,ALV-J给世界禽养殖业造成了严重打击。目前还没有药物或疫苗能用来治疗或预防ALV-J。近年来海藻多糖被发现对多种病毒均具有抑制效果,且由于其生物安全性高,同时具有抗病毒和免疫调节活性两方面的功效,越来越受到研究者的青睐。但天然的海藻多糖分子量巨大,粘度高,溶解性差,
【机 构】
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中国科学院大学(中国科学院海洋研究所)
【出 处】
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中国科学院大学(中国科学院海洋研究所)
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J亚群禽白血病病毒（ALV-J）是一种能够诱发鸡髓细胞性白血病的病毒,它能造成鸡群免疫抑制、引起继发感染甚至肿瘤性死亡。自发现以来,ALV-J给世界禽养殖业造成了严重打击。目前还没有药物或疫苗能用来治疗或预防ALV-J。近年来海藻多糖被发现对多种病毒均具有抑制效果,且由于其生物安全性高,同时具有抗病毒和免疫调节活性两方面的功效,越来越受到研究者的青睐。但天然的海藻多糖分子量巨大,粘度高,溶解性差,限制了其应用。低分子海藻多糖较好的克服了海藻多糖的缺点,具有水溶性好、稳定性高和易吸收等特点,因此,将低分子量海藻多糖应用于预防ALV-J的研究具有重要意义。本实验室首次将海藻多糖用于抵抗ALV-J,并在前期研究中发现,不同分子量的羊栖菜多糖比蜈蚣藻和孔石莼多糖具有更好的抗ALV-J效果,其中9kDa的低分子量羊栖菜多糖抗病毒活性最好,但其抗病毒机理和体内抗病毒效果尚不明确,且抗病毒活性不够稳定。纳米胶束是一种由亲水和疏水区域构成的两亲性分子聚集体,因其制备方便、良好的生物相容性和高载药量等特点,常作为载体用于药物运输。有研究表明,直接对药物进行亲水或疏水改性修饰后制备成纳米胶束在一定程度上减少了疏水或亲水片段的引入,降低了引入片段可能带来的副作用,修饰后药物的原有活性还通常获得不同程度的提高。因此,本文在前期的研究基础上,选用9kDa的低分子量羊栖菜多糖,在体外研究其抗ALV-J机理,在体内探究其抗ALV-J的活性。并对其进行疏水性修饰,将衍生物自组装成纳米胶束,在体外评价其抗病毒效果。主要研究结果如下:1)体外成功制备了ALV-J中与细胞识别结合的gp85蛋白,利用表面等离子共振技术发现低分子量羊栖菜多糖能与gp85蛋白发生结合,说明低分子量羊栖菜多糖是通过与gp85蛋白结合抑制了病毒识别吸附宿主细胞,从而起到抗病毒效果。结合速率常数（ka）、解离速率常数（kd）和亲和力常数（KD）分别为7.020（1/Ms）、0.001489（1/s）和3.940×10-5（M）,且这种结合与多糖的硫酸根含量有关。体内实验表明,低分子量羊栖菜多糖在体内能显著抑制ALV-J,提高感染ALV-J鸡的体重和免疫器官指数,促进鸡外周血淋巴细胞增殖,提高CD4+和CD8+T淋巴细胞比例,促进IL-2和IFN-γ的分泌,同时还能有效提高鸡体NDV抗体的分泌,显著降低ALV-J的排毒量,缓解ALV-J对鸡体器官造成的损伤。2)成功制备了低分子量羊栖菜多糖月桂酸、肉豆蔻酸和棕榈酸衍生物,自组装为纳米胶束（SFP-C12M、SFP-C14M和SFP-C16M）,并对其进行表征。三种胶束粒径约在200nm左右,多分散系数分别为0.15±0.041、0.096±0.03和0.153±0.015。zeta电位低,均在-40m V左右。临界胶束浓度低,分别为0.0088、0.005和0.0121mg/m L,说明三种胶束较稳定。三种胶束在扫描电镜下呈均匀光滑球形,分散、均一,且粒径大小与纳米粒度仪检测结果一致,进一步证明纳米胶束合成成功。体外抗病毒实验表明,纳米胶束均能显著抑制ALV-J基因和p27蛋白表达,且SFP-C14M和SFP-C16M的病毒基因相对表达量显著低于低分子量羊栖菜多糖处理组,证明其抗病毒效果优于低分子量羊栖菜多糖,其中SFP-C16M活性最好。3)相比于低分子量羊栖菜多糖仅在病毒吸附宿主细胞阶段起作用,SFP-C16M在病毒繁殖阶段也具有一定抑制效果,说明经疏水化改性并自组装为纳米胶束的低分子量羊栖菜多糖出现了新的抗ALV-J机制。我们采用磷脂囊泡模型进一步研究纳米胶束与病毒的作用机制。结果表明,100μg/m L的SFP-C16M在24h时可以将磷脂囊泡完全破坏,浓度为300μg/m L的SFP-C16M在6h内基本可将囊泡瓦解,而低分子量羊栖菜多糖基本不存在这种作用,说明低分子量羊栖菜多糖纳米胶束可能通过瓦解病毒囊膜来起到抗病毒作用。综上所述,低分子量羊栖菜多糖通过与ALV-J gp85蛋白结合来抑制病毒吸附宿主细胞,且在体内能显著抑制ALV-J,降低病毒对鸡体生长的抑制和器官造成的损伤,缓解ALV-J对鸡体造成的免疫抑制,提高鸡体免疫。将低分子量羊栖菜多糖与长链脂肪酸制备成纳米胶束后,其抗ALV-J活性得到提高,且在病毒繁殖阶段也具有一定抑制效果,这可能是通过瓦解病毒囊膜来实现的。本研究为海藻多糖作为新型抗病毒兽药的研究和应用提供理论依据。
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