研究背景端粒是位于真核染色体末端,由短的DNA重复序列TTAGGG和相关蛋白质组成的复合物。其主要作用是保护染色体,既可防止染色体被核酸酶降解,同时又能阻止相邻染色体间的融合。另外,端粒的长度反应细胞的可分裂次数,因此,被称为细胞的“生命钟”。正常情况下,端粒DNA会随着细胞的每次分裂而缩短50-200个碱基对,当其缩短到一定长度时,染色体则无法完成正常复制,细胞的有丝分裂也会随之停滞,转而进入衰老阶段。端粒酶是一种RNA依赖的DNA聚合酶,由催化组分端粒酶逆转录酶(hTERT)、端粒酶模板RNA (hTER)以及端粒酶相关蛋白质组成,其主要作用是延长端粒的长度。在正常的成熟体细胞中,端粒酶几乎没有活性,但是,在病理状态下,如肿瘤细胞中,其活性异常增高,使端粒长度得以延长,从而保证了肿瘤细胞的无限分裂增殖。由此可见,端粒酶活性的异常升高所导致的端粒长度的维持,与肿瘤的发生发展密切相关。硼替佐米是已经应用于临床的用来治疗多发性骨髓瘤的一种药物,作为26S蛋白酶体的抑制剂,其已知的主要作用机制是通过抑制NF-κB信号途径,进而激活caspase3,同时抑制抗凋亡基因bcl-2的表达,来诱导肿瘤细胞的凋亡。虽然硼替佐米在多发性骨髓瘤的治疗中已经取得了良好疗效,但仍有部分耐药病例出现,因此,我们亟需寻找硼替佐米新型的作用机制以及靶点分子,以使其获得更加合理的临床应用。肿瘤抑制因子aridla是染色质重构复合体SWI/SNF的重要组成成分,可结合于DNA的特定区域,此复合体中的另一成员BRG1或BRM可水解ATP产生能量,利用这些能量,SWI/SNF重构复合体可使染色质中核小体的组蛋白核心发生移位甚至脱落,从而转移核小体的位置,改变染色质的构象,使下游基因的转录起始部位暴露或隐藏,由此来调控下游基因的转录。目前,众多的基因测序结果显示,在卵巢癌、胃癌、肾癌、胰腺癌等绝大多数肿瘤中都存在ARID1A基因的突变或缺失,这提示aridla可能作为一种抑癌基因来行使作用。但是,具体的抑癌机制目前研究尚少。研究目的1.探讨硼替佐米诱导肿瘤细胞凋亡的过程中,对端粒酶活性和端粒功能的影响,以发掘其新的作用机制,并对肿瘤细胞产生硼替佐米耐药过程中hTERT所发挥作用进行研究。2.探讨胃癌细胞中aridla对hTERT表达的调控及其相关机制,为aridla的抑癌作用提供证据支持。研究方法和结果1.硼替佐米降低端粒酶活性和端粒稳定性诱导肿瘤细胞凋亡(1)硼替佐米抑制肿瘤细胞端粒酶活性,同时降低其端粒稳定性。硼替佐米处理白血病细胞HEL和胃癌细胞BGC-823前后,分别用PCR-ELISA试剂盒检测端粒酶活性,qRT-PCR检测hTERT、hTER及端粒结合蛋白TRF1、TRF2、 POT1、RAP1、TPP1及TIN2的mRNA表达,Western Blotting检测TRF1、TRF2、POT1的蛋白表达,流式-荧光原位杂交(Flow-FISH)和qPCR检测端粒长度,免疫-荧光原位杂交(Immuno-FISH)检测端粒DNA的损伤。结果表明,硼替佐米可下调hTERT、hTER的mRNA表达水平,降低端粒酶活性,使端粒结合蛋白的表达广泛失调,缩短端粒长度并导致端粒功能异常。(2)hTERT高表达可减弱由硼替佐米引起的端粒功能异常。硼替佐米处理稳定高表达hTERT基因的细胞株HEL-hTERT、BGC-823-hTERT后,Flow-FISH和qPCR检测细胞端粒长度,Immuno-FISH检测端粒DNA损伤,qRT-PCR检测端粒结合蛋白TRF1、TRF2、POT1、RAP1、TPP1及TIN2的mRNA表达,Western Blotting检测TRF1、TRF2、POT1的蛋白表达。结果表明,硼替佐米处理后HEL-hTERT和BGC-823-hTERT细胞中端粒长度无明显改变,端粒DNA损伤和端粒结合蛋白的表达失调程度明显弱于相同浓度硼替佐米处理的HEL-control和BGC-823-control细胞。(3)hTERT高表达可抑制由硼替佐米所诱导的肿瘤细胞凋亡。硼替佐米处理稳定高表达hTERT基因的细胞株HEL-hTERT、BGC-823-hTERT与对照细胞株HEL-control、BGC-823-control后,台盼蓝染色计数确定细胞的存活率,Annexin-V染色后流式细胞术检测细胞的凋亡率。结果表明,硼替佐米处理后,HEL-hTERT和BGC-823-hTERT细胞的存活率明显高于HEL-control和BGC-823-control细胞,而HEL-hTERT和BGC-823-hTERT细胞的凋亡比例明显低于HEL-control和BGC-823-control细胞。(4)hTERT通过减弱DNA损伤和上调bcl-2表达抑制肿瘤细胞凋亡。硼替佐米处理稳定高表达hTERT基因的细胞株HEL-hTERT、BGC-823-hTERT与对照细胞株HEL-control、BGC-823-control后,免疫荧光检测DNA损伤,即53BP1的凝集,Western Blotting检测bcl-2的表达。结果表明,HEL-hTERT与BGC-823-hTERT细胞中的DNA损伤明显少于HEL-control、BGC-823-control细胞,HEL-hTERT细胞内bcl-2表达明显高于HEL-control细胞,且在硼替佐米处理后HEL-hTERT细胞内仍存留较多量的bcl-2蛋白。2.染色质重构分子ARID1A负性调控hTERT抑制胃癌进展(1)arid1a负性调控hTERT表达。胃癌细胞系AGS和SGC中转染arid1a高表达或对照质粒PcDNA 6.0后,采用qRT-PCR和western blotting分别检测hTERT的mRNA及蛋白表达水平。结果表明,aridla高表达后,hTERT的mRNA及蛋白表达均下降。(2) arid1a抑制hTERT启动子活性。AGS和SGC细胞中转染aridla高表达或对照质粒PcDNA 6.0后,再转染hTERT启动子报告基因质粒,然后采用双荧光素酶报告基因系统检测hTERT启动子活性。结果表明,arid1a高表达后,hTERT启动子活性明显降低。(3)arid1a抑制c-myc在hTERT启动子区的结合,但不改变c-myc的表达量。AGS和SGC细胞中转染arid1a高表达或对照质粒PcDNA 6.0后,qRT-PCR检测c-myc的mRNA表达,结果显示arid1a未影响c-myc的mRNA水平。在转染了arid1a高表达或对照质粒PcDNA6.0的AGS和SGC细胞中,转染c-myc结合位点突变的hTERT启动子质粒,用双荧光素酶报告基因系统检测突变的hTERT启动子活性,结果显示,其活性未受arid1a高表达的影响。研究结论1.硼替佐米可以通过降低HEL和BGC-823细胞的端粒酶活性和端粒稳定性诱导细胞凋亡,而hTERT可减弱硼替佐米对端粒功能的影响,介导肿瘤细胞对硼替佐米的耐药。2. Aridla通过阻碍c-myc在hTERT启动子区的结合来抑制hTERT的表达,从而抑制胃癌进展。