论文部分内容阅读
本研究分为两部分:第一部分:FHL1与Smad4协同抑制JVEGF信号通路血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor, VEGF)在缺血,急慢性炎症,以及肿瘤及创伤等血管生成异常疾病中起着重要作用。很多因子可以调节VEGF启动子活性及VEGF的表达。FHL1(four and a half LIM domains1)与Smad4便是其中2个可以调节VEGF启动子活性及VEGF的表达的因子。FHL-1隶属于LIM-only蛋白家族,这个家族可以调节基因转录、细胞增殖、分化与凋亡。Smad4是一种抑癌基因,最早发现于胰腺癌第4位点基因缺失(DPC4)。本研究为了确定FHL1与Smad4是否可以协同抑制VEGF信号通路。结果显示过表达的FHL1与Smad4可以协同抑制VEGF信号通路,而敲低内源性表达的Smad4与FHL-1则会刺激VEGF信号通路,并且敲低内源性Smad4表达会消除FHL-1介导的抑伟VEGF启动子活性作用。结论,本研究证实了FHL1与Smad4可以协同调节VEGF信号通路,可能发现了一种新的肿瘤的进展与转移机制。第二部分:MARK1对VEGF信号通路的调节本研究通过荧光素酶活性实验从704个转录调节因子中筛选出可以抑制VEGF启动子活性的Mark1蛋白。微管亲和力调节酶(microtubule affinity-regulating kinase, MARK)最初从小鼠脑组织中纯化出来,具有丝氨酸苏氨酸激酶活性。MARK蛋白属于AMPK/Snfl亚家族CaMKⅡ激酶组,有着保守结构域结构可以分为6个结构域,分别是:1.N端,2.催化域,3.普通停靠区域,4.泛素相关区域,5.沉默区,6.C端尾巴。接着本研究证实了Mark1抑制VEGF启动子活性成剂量依赖方式,并且同时通过Real-time PCR证实Mark1抑制VEGF启动子活性,构建了VEGF启动子突变体,利用荧光素酶活性实验证实VEGF启动子-800/-600是Mark1与其作用区域,并且构建Mark1相关突变体证实在103aa-311aa是Mark1抑制VEGF启动子的活性区域。同时通免疫组化实验证实Mark1在乳腺癌标本中癌旁组织表达高于癌组织,提示其可能机制是在乳腺癌组织中Mark1缺失,其抑制VEGF信号通路作用减弱,而促进乳腺癌的发生。