研究背景与目的： 胰岛素样生长因子结合蛋白-4(insulin-likegrowthfactorbindingprotein-4，IGFBP-4)作为一个重要的细胞因子，具有多种重要的生理功能。它既是构成动物GH/IGF生长轴的一个重要成员，同时又是一个重要的抗癌蛋白，对绝大多数体外培养肿瘤细胞具有抑制生长和促进细胞凋亡的作用。对IGFBP-4的研究受到越来越广泛的重视。鹿茸是一种神奇的名贵中药，不仅具有其独特的药用价值，而且具有重要的科学研究意义。在动物的进化过程中，脊椎动物逐渐失去了肢体附属器官再生的能力，但鹿茸角作为一种复杂的哺乳动物附属器官，却能每年从角柄上脱落和完全再生。而且鹿茸生长速度之快在哺乳动物组织生长中也是绝无仅有的。鹿茸角为我们研究哺乳动物组织器官的再生、创伤修复以及癌症发生等提供了理想模型。 本研究通过克隆人IGFBP－4cDNA、构建原核表达载体、并进行高效表达和纯化，利用基因工程技术来生产重组蛋白；利用纯化的重组IGFBP-4蛋白进行晶体生长，为进一步解析其三维结构、研究其结构与功能的关系奠定基础；利用体外细胞培养实验，研究其对鹿茸细胞增殖分裂及凋亡的影响，为进行鹿茸再生机理的深入研究开辟了新的途径。 材料与方法： 根据GenBank中人IGFBP-4成熟肽的cDNA序列，结合表达载体pGEX-6P-1的特点设计、合成一对特异性引物。采用PER的方法扩增人成熟IGFBP-4蛋白cDNA片段，然后将其定向克隆剑载体pGEX-6P-1中，构建原核表达重组载体pGEX-6p-1-BP4；重组载体转入大肠杆菌DH5α扩增、提取后，用PCR、限制性内切酶酶切以及DNA序列测定等方法进行鉴定。鉴定正确的阳性pGEX-6p-1-BP4重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，通过Amp抗性筛选获得稳定表达的阳性工程菌；以IPTG诱导工程菌高效表达重组蛋白IGFBP-4，利用GST亲合层析、琼脂糖凝胶层析对重组IGFBP4蛋白进行分离纯化，并进行Westernblot检测；最后通过晶体生长和体外细胞培养实验对重组IGFBP4蛋白进行结构和功能的研究。 实验结果： 1、成功的构建了IGFBP-4cDNA原核表达载体pGEX-6p-1-BP4；建立了稳定转化pGEX-6p-1-BP4重组质粒的大肠杆菌细胞株BL21-pGEX-6p-1-BP4，并使IGFBP-4cDNA在转化细胞内获得高效稳定表达。 2、确立了工程菌以可溶性形式高效表达重组IGFBP4蛋白的培养条件。重组工程菌pGEX-IGFBP-4/BL21(DE3)的最佳表达条件确定为；温度16℃、IPTG浓度为0.6mM、诱导时间为20小时。建立了高效纯化重组IGFBP4蛋白的工艺，较好地纯化出了IGFBP-4蛋白，蛋白质纯度达到97％以上，为以后进行IGFBP4蛋白结构和功能的研究创造了条件。 3、本研究在生长温度为13℃，18％聚乙二醇8000，0.2mol/L醋酸钙，0.1M二甲胂酸钠，pH6.5条件下，成功地生长了重组IGFBP-4蛋白的晶体，并进行了晶体生长条件的优化，得到了可供蛋白质三维结构解析所需要的蛋白质晶体。 4、首次发现IGFBP－4蛋白对鹿茸细胞的增殖抑制作用，为进一步研究其在鹿茸生长和再生中的作用、阐明GH/IGF轴的生长调控机理开辟了新的可能途径。 结论： 本研究利用基因工程技术成功的构建了IGFBP-4cDNA原核表达载体，获得了稳定高效表达可溶性重组IGFBP-4的工程菌；经过GST亲合层析和琼脂糖凝胶过滤层析对重组IGFBP4蛋白进行分离纯化，获得了高纯度的有生物活性的目的蛋白；利用纯化的目的蛋白成功地生长出了可供三维结构解析的优良晶体，并证明了重组IGFBP-4对鹿茸细胞增殖具有抑制活性。为进一步深入研究IGFBP－4的结构与功能，研究鹿茸生长及再生的分子机理奠定了基础。