β-淀粉酶调控糖代谢参与葡萄的抗寒机理研究

来源 :甘肃农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:ahaulxg
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我国西北地区土地辽阔,光照充足,昼夜温差大且病虫害少,有利于葡萄品质的形成。然而,该地区冬季极端低温干燥使得葡萄植株冬季需埋土防寒和春季出土生长,这一方式导致种植成本增加和生态环境破坏,严重的制约了葡萄产业的发展。因此,探究葡萄的抗寒机理和培育耐寒品种则成该地区葡萄种植的首要任务之一。然而长期以来以糖为枢纽参与调控葡萄耐寒性的机理鲜有报道。为了阐明糖代谢响应抗寒的分机制,本研究选择耐寒性强的山葡萄(Vitis amurensis,‘左山I号’,标记为LR)和耐寒性弱的梅鹿辄(‘Merlot’,标记为S)植株在自然生长条件下进行低温锻炼,包括生长期(28±1°C,标记为A),抗寒初期(5±1°C,标记为B),抗寒中期(0±1°C,标记为C),抗寒后期(温度为-5±1°C,标记为D)和深休眠期(-10±1°C,标记为E)5个时期,随后测定枝条韧皮部中可溶性糖、激素及相关酶活性,并进行转录组测序。分析转录组数据获得候选的抗寒功能基因,并在番茄、拟南芥和葡萄愈伤组织中进行抗寒性鉴定及互作蛋白筛选,最终获得以下主要研究结果:(1)低温锻炼期不同温度下LR和S韧皮部中的葡萄糖、果糖、蔗糖和ABA含量随着温度的降低逐渐增加,淀粉含量、总淀粉酶、β-淀粉酶(BAM)、蔗糖合成酶(Su Sy)、蔗糖磷酸合成酶(SPS)和酸性转化酶(AI)活性则表现出先增强后减弱的趋势,而IAA含量逐渐下降。LR和S中淀粉含量的峰值出现在B时期,分别为57.63mg/g FW和48.80 mg/g FW,Su Sy、SPS和AI的活性峰值也出现在该时期。总淀粉酶和BAM活性的最高峰出现在C时期。此外,上述这些生理指标在整个低温锻炼期LR高于S。(2)低温锻炼期不同温度下LR和S韧皮部进行转录组测序,结果显示仅在B和E时期处理下LR中上调差异表达基因(DEGs)的数量大于S中下调的DEGs数量。此外,从LR和S中共鉴定出了11343个DEGs,包括4913个的DEGs和6431个下调的DEGs。在ABA生物合成与信号转导通路中,CRTISO、AOG、PYL4-1、PYL4-2、P2C08、SAPK2、TRAB1和DPBF3基因在LR中上调表达,而在S中表达无明显趋势。在淀粉和蔗糖代谢通路中,HXK1、PGMP、GLGL1、SUS6-1、VCINV、CWINV1、BAM1、BAM3和TPS6在LR的转录水平高于S。(3)在葡萄基因组数据中共鉴定出了6个BAM基因成员,被聚类在3个亚家族中。蛋白序列显示葡萄BAM成员均包含葡萄糖苷水解酶结构域、Glu186催化残基。q RT-PCR结果显示Va BAM1在LR低温锻炼期逐渐上调表达。此外,过表达Va BAM1的番茄和拟南芥植株与未转化植株相比,低温胁迫后抗氧化酶活性、淀粉酶活性、可溶性糖含量均增加,淀粉含量明显降低,且番茄自噬体数量也明显增加。(4)分析了低温胁迫后过表达Va BAM1的葡萄愈伤组织(Va BAM1-OEs)与未转化和编辑Va BAM1后的阳性愈伤组织相比,结果显示Va BAM1-OEs周围长出了新的愈伤组织,且淀粉酶活性及可溶性糖含量均增加,而淀粉含量则显著下降。此外,Vv CBF3、Vv CBF4、Vv CBF6、Vv COR27和Vv COR41均在低温胁迫后的Va BAM1-OEs中上调,而在Va BAM1编辑后的愈伤组织中下调。(5)通过酵母双杂交和双分子荧光互补实验,鉴定出了与Va BAM1互作的蛋白Va SR1。亚细胞定位显示Va SR1主要在细胞核中表达。低温胁迫后,过表达Va SR1的葡萄愈伤组织(Va SR1-OEs)褐化不生长,且淀粉含量增加,而淀粉酶活性和可溶性糖含量下降,BAM1的表达被抑制。此外,过表达Va SR1的拟南芥与未转化植株相比,低温胁迫后叶片中淀粉含量增加,而淀粉酶活性和可溶性糖含量降低,植株的耐受性减弱。
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