研究背景与目的:心房颤动(Atrial fibrillation)是临床最常见的心律失常之一,据流行病学调查显示,我国三十岁以上的人群,心房颤动的患病率为0.77%,且该患病率呈现随年龄增长而逐渐增加的趋势,其中男性患病率高于女性,但在女性绝经期后,男女患病率没有明显差异。心房颤动常发生于某些器质性心血管疾病,如高血压病、冠心病、心肌病、心脏瓣膜病及心力衰竭等,其发病率增加和心力衰竭患者死亡率增加相关,最主要危害是卒中。然而,大多数心房颤动的发病原因不明。有研究证实14%的心房颤动由高血压病导致,且高血压病是新发心房颤动的独立预测因素。临床上可见某些心房颤动患者血尿酸(Uric acid)值偏高,除合并高血压外无其他心血管病并存。尿酸是近年来新发现的一个与多种心血管疾病发病率及死亡率有关的危险因素,作为人体内嘌呤核苷酸代谢的终产物,尿酸如何引起心房颤动发生,尚不清楚!我们推测高尿酸血症可影响心房肌小动脉血管内皮细胞功能,导致血管舒张能力下降,血管持续收缩,引起局部心肌发生缺血性改变及纤维化,进而导致心房结构改变及心房颤动发生。而动脉血管舒张功能和血管内皮细胞合成的内皮型一氧化氮合酶(eNOS)关系密切,eNOS可催化L-精氨酸生成一氧化氮(NO),而NO有强大的血管舒张作用。当eNOS表达水平下降时,NO减少将会使血管舒张功能受到影响。此外,醛固酮合酶CYP11B2基因多态性将会影响肾功能,导致尿酸排泄障碍,从而引发高尿酸血症。据此认为,高血压病患者心房颤动的发生可能与血尿酸代谢异常及醛固酮合成酶CYP11B2-344T>C基因多态性有关。为验证上述假设,本研究将通过临床病例回顾性分析、用不同浓度尿酸干预人类动脉血管内皮细胞观察其对于eNOS表达水平的影响及CYP11B2-344T>C基因多态性对心房颤动易感性影响的荟萃分析,多角度探讨高血压病患者心房颤动发生的相关因素及可能机制。研究方法:一、病例资料回顾性分析研究1.选择2010年1月至2014年12月在我院心内科住院的高血压病患者为研究对象,所有患者均符合中国高血压防治指南制定的高血压病诊断标准,心房颤动以经体表12导联心电图或24小时动态心电图诊断为标准。并以此分为高血压病合并心房颤动组与高血压病对照组。2.排除标准为:合并冠心病、继发性高血压、心脏瓣膜病、先心病、心肌病、心力衰竭、心脏手术后、糖尿病、家族性血脂异常、甲状腺功能异常、血清肌酐大于110μmol/l、重度感染性疾病、自身免疫性疾病或炎症性疾病、呼吸系统疾病及应用影响尿酸代谢药物(利尿剂除外)的患者。3.查阅电子病历数据库,完整记录所有入选患者的基本信息、临床基本指标及相关辅助检查结果,进行统计学分析。二、尿酸对人动脉血管内皮细胞功能影响及机制研究1.应用不同浓度尿酸(400umol/l,600umol/l,800umol/l,1000umol/l)作用于人冠状动脉血管内皮细胞和人脐静脉血管内皮细胞,应用real-time-pcr和westernblot检测不同浓度尿酸作用下enosmrna和蛋白表达水平的变化,从而筛选出最适合的尿酸浓度。并以此尿酸浓度作用于两种人血管内皮细胞,应用real-time-pcr和westernblot方法在不同时间点检测enosmrna和蛋白表达水平变化,从而选出变化最明显的时间点进行实验。2.用转录抑制剂放线菌素d预处理人血管内皮细胞,再以尿酸进行干预,应用real-timepcr在不同时间点检测enosmrna表达水平,以判断尿酸对rna稳定性的影响。3.用enos特异性抑制剂l-name预处理人血管内皮细胞,再用尿酸进行干预,mtt方法检测内皮细胞增殖情况,以判断尿酸对内皮细胞增殖的影响是否直接与enos有关。4.用westernblot方法分别检测不同时间点(10min,20min,30min,40min)经尿酸作用的人血管内皮细胞mapks(p38mapk,jnkmapk,erkmapk)通道是否有激活,判断不同血管内皮细胞是否被激活的mapks通道种类及激活时间不同。5.应用p38mapk通道特异性药物抑制剂(sb203580)预处理人冠状动脉血管内皮细胞,然后加入尿酸,通过real-timepcr的方法检测enosmrna表达水平变化,判断尿酸对enosmrna表达水平的调节是否通过p38mapk通道激活实现的。应用腺病毒负性突变体p38-dn-adv转染人冠状动脉血管内皮细胞后再加入尿酸,通过westernblot方法检测enos蛋白表达水平的变化,判断尿酸对enos蛋白表达水平的调节是否通过p38mapk通道激活实现的。6.pgl2-enos(-331/+109)-fireflyluciferasereporter质粒和pgl2-β-actin-renillaluciferase共转染hcaec细胞后,加入600umol/l尿酸继续培养,双荧光报告基因系统检测尿酸是否影响enos启动子的活性,判断尿酸是否在转录前水平调节enos基因表达。7.用染色质免疫共沉淀技术检测转录因子gata-4与enos启动子的结合情况,以判断尿酸是否对该结合状况有影响。8.通过大鼠腹腔动脉血管环实验检测尿酸对动脉血管舒张功能的影响,并进行统计学分析。三、cyp11b2-344t>c基因多态性与高血压病心房颤动发生的相关性1.通过病例-对照研究进行meta分析,探讨cyp11b2-344t>c基因多态性和心房颤动易感性的关系。2.应用统计软件计算等位基因模型,纯合子模型,隐性模型和显性模型的优势比(or)和95%可信区间(ci),并通过固定效应和随机效应模型评估二者的关联性。3.根据异质性来源的不同进行亚组分析,最后达到应用单一原因对于总体结果进行评价,并对文章的发表偏倚进行评估。研究结果:1.研究发现高血压病患者血尿酸水平升高与心房颤动的发生密切相关(1)本研究共纳入940例患者,其中高血压病合并心房颤动患者362例,高血压病不合并心房颤动患者578例(对照组)。两组患者的性别、白细胞值、血钾值、肌酐值、收缩压、舒张压、左心室后壁厚度及室间隔厚度与心房颤动发生的风险均无统计学差异(p>0.05)。与对照组比较,高血压病合并心房颤动组平均年龄更大(67.13±10.59vs.56.78±14.92,p<0.01)、患高血压病平均时间更长(9.27±9.50vs.3.85±3.57,p<0.01),且血尿酸水平及左心房直径明显高于对照组,分别为388.11±112.51vs.311.54±122.51(p<0.01)及45.79±7.56vs.34.08±4.36(p<0.01)。(2)通过患者年龄、患高血压病年限、血尿酸水平及左心房直径对心房颤动发病风险预测进行logistic回归分析发现,心房颤动发病风险和患者血尿酸值(or=1.014;95%可信区间=1.005-1.023,p=0.002)及左心房直径(or=1.390;95%可信区间=1.221-1.582,p<0.001)具有独立的相关性。2.研究发现尿酸对人动脉血管内皮细胞功能产生明显影响(1)不同浓度尿酸作用于人冠状动脉血管内皮细胞和人脐静脉血管内皮细胞后检测结果显示:尿酸浓度为600umol/l和1000umol/l时,24小时hcaec细胞enosmrna表达量分别降低39.22%和69.22%(p<0.01);蛋白表达量分别降低62.10%和65.67%(p<0.05)。在huvec细胞中,当尿酸浓度为600umol/l和1000umol/l时,24小时enosmrna表达水平分别下降27.44%和51.87%(p<0.01);蛋白表达水平分别下降7.21%(p>0.05)和52.88%(p<0.01);当尿酸作用达48小时,600umol/l浓度组enos蛋白表达量下降40.31%(p<0.01)。(2)用转录抑制剂放线菌素d1ug/ul预处理人血管内皮细胞,再用600umol/l尿酸干预hcaec细胞和huvec细胞,与无放线菌素d的尿酸组比较,两种细胞enosmrna降解趋势无显著性差别。(3)用enos特异性抑制剂l-name100um预处理人血管内皮细胞,再应用600umol/l尿酸干预,与无l-name的尿酸组比较,hcaec和huvec细胞增殖趋势无明显差异。(4)600umol/l尿酸作用于hcaec细胞时,p38mapk通道和erkmapk通道分别被激活,相同浓度尿酸作用于huvec细胞时,被激活的通道是jnkmapk和erkmapk通道。(5)用p38mapk通道特异性药物抑制剂(sb203580)预处理hcaec细胞后,加入600umol/l尿酸,与对照组比较enosmrna表达水平几乎无变化,表明尿酸降低enosmrna表达的作用被逆转。(6)腺病毒负性突变体p38-dn-adv转染hcaec细胞,再加入600umol/l尿酸,与对照组比较enos蛋白表达水平几乎无变化,表明尿酸降低enos蛋白表达的作用被逆转。(7)pgl2-enos(-331/+109)质粒转染hcaec细胞后,加入600umol/l尿酸继续培养24小时后,检测细胞enos启动子活性较无尿酸对照组下降43.58%(p<0.01)。(8)染色质免疫共沉淀技术检测与对照组相比,尿酸使转录因子gata-4与hcaec细胞启动子的结合力增强。(9)在内皮依赖型缓激肽作用下,对照组大鼠离体腹腔主动脉血管环发生舒张。作为阴性对照组的l-name组动脉血管环舒张幅度明显减弱,和对照组相比,尿酸组动脉血管环的舒张幅度减弱48.53%(p<0.01)。3.通过9项病例对照研究证实,在高血压病人群中,cyp11b2-344t>c多态性明显与心房颤动易感性显著相关(等位基因模型:or=1.18,95%ci=1.04-1.33,p<0.01;纯合子模型:or=1.54,95%ci=1.17-2.03,p<0.01;隐性模型:or=1.70,95%CI=1.24-2.32,p<0.01)。结论:1.初步阐明了尿酸代谢异常促发高血压病患者心房颤动发生的作用及可能机制。即尿酸通过下调HCAEC细胞eNOS mRNA和蛋白表达水平,影响动脉血管舒张功能,使血管持续收缩,进而导致局部心房肌发生缺血性变化及纤维化,成为心房颤发生的因素。2.从临床和基础研究两个方面均证实了血尿酸水平与心房颤动发生密切相关,这种相关性在高血压病合并心房颤动患者中表现尤为明显。3.通过Meta分析从基因多态性的角度分析高血压病心房颤动的病因,证实在高血压病人群中,CYP11B2-344T>C基因多态性与心房颤动易感性存在显著的相关性。丰富了对心房颤动发病因素的认识,4.通过心房颤动病因方面的认识,可以从控制体内尿酸值的角度预防高血压病患者心房颤动的发生,为临床防治高血压病心房颤动的发生提供了新的思路。