人类免疫缺陷病毒1型(Human immunodeficiency virus1, HIV-1)和艾滋病(Acquired Immunodeficiency Syndrome, AIDS)发现至今已有三十余年,目前仍然严重威胁着人类的健康和生命。现阶段HIV疫苗研发尚未成功,临床上抗病毒治疗仍然占据主导地位；现有抗HIV药物和治疗方案虽然能够有效抑制感染者及病人体内病毒复制,降低病毒载量,延缓疾病进程和延长病人寿命,但是仍然无法完全清除感染者及病人体内潜伏病毒。原因在于,HIV作为逆转录病毒,其逆转录酶缺乏校正活性,在体内复制的过程中产生大量变异,在临床治疗过程中,这些残余病毒在药物选择压力下产生耐药突变累积,造成病毒载量反弹,这是艾滋病患者抗病毒治疗失败的主要原因。因此,新药研发和组合用药方案的评估工作势在必行,体内药物有效性评价在指导临床用药方面起着至关重要的作用。然而目前,临床上研究分析受到一些不确定因素的影响,如无法长期监测病人体内病毒变异和耐药性突变,同时动物模型中缺乏合适的靶标病毒,二者共同制约了该领域研究的发展。针对此现状,本研究从以下两个方面展开：第一部分,以艾滋病恒河猴药物模型为基础,探究体内病毒长期变异及耐药性突变的产生机制；第二部分,构建涵盖多个艾滋病药物靶点的嵌合病毒,用于组合药物筛选研究。一方面,在本实验室建立的RT-SHIV、SIV恒河猴药物评价模型的基础上通过监测给药期间与给药前或者给药后血浆病毒,发现RT-SHIV/TC模型G1102V、G1104V、G1105V和G1106V,以及RT-SHIV/AE模型G1109V体内病毒对齐多拉米双夫定敏感性下降,SIVmac239模型RM39、090671、090665和081363对PMPA敏感性下降,提示体内耐药病毒株的出现。为系统监测RT基因耐药位点的变化,本研究建立了一种能从感染猴血浆中扩增全长rt基因的PCR方法。使用BioEdit和DNAMAN软件进行氨基酸序列比对,发现G1102V在给药过程中体内病毒发牛17处氨基酸改变,其中M184V为一处已知的抗胞嘧啶类似物药物拉米夫定(3TC)突变位点,1215T为一处T215的回复突变,该突变本身不会影响病毒对核苷类逆转录酶抑制剂的敏感程度,但是提示体内可能存在一些像T215Y/F这样的抗拉米夫定(3TC)突变的存在；G1109V猴体内病毒在给药前就发生了6处氨基酸突变,虽然没有发现已知的抗齐多拉米双夫定的耐药突变位点,但很可能存在一些潜在的耐药突变,并在药物的选择压力下累积,从而造成了该猴在给药过程中血浆病毒载量反弹：SIVmac239感染的4只猴在给药之后体内病毒共有8处氨基酸改变,其中S205L和M502I共同存在于4只猴中,提示可能为抗PMPA潜在的耐药突变位点。另一方面,以SIVmac239全长质粒为骨架,利用基因工程手段替换进HIV-1完整pol基因共得到9株嵌合病毒质粒,同时含有HIV-1蛋白酶、逆转录酶和整合酶3个药物靶点,拟用于多种药物组合用药评估；转染293T细胞,收集转染上清,发现8株嵌合病毒均能高水平表达SIV骨架上的Gag P27蛋白,同时两株嵌合病毒SHIV-pol-NL43和SHIV-pol-32具有逆转录酶活性；分别感染TZM-b1细胞和CEMx174细胞鉴定其感染和复制能力,结果发现在检测的时间段内感染和复制能力较弱。通过定点突变技术将SHIV-pol-32质粒上由于构建过程中酶切位点的引入而造成的一处氨基酸改变回复得到SHIV-pol-32-XCApa,感染CEMx174细胞的第9天可以在细胞表面检测到病毒蛋白,说明成功构建一株具有感染性SHIV-pol病毒株,进一步细胞和动物水平传代适应,以获得感染和复制能力较强的嵌合病毒株,本研究为构建新型艾滋病药物模型奠定了基础。综上所述,本次研究完善了RT-SHIV和SIV/恒河猴药物评价模型,发现了一些已知的和潜在的与耐药性相关的突变位点。构建得到了一系列的替换进HIV-1全长pol基因的SHIV-pol嵌合病毒,本研究为优化现有艾滋病药物模型提供了必要信息,为探索构建新型艾滋病药物模型奠定了基础。