基于藤壶胶蛋白cp19k的纤维性融合蛋白的设计表达及超声处理效应研究

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胶粘剂的应用十分广泛,但目前的胶粘剂难以同时满足湿粘附性能和生物相容性的要求,解决潮湿环境下的粘附难题仍是一项巨大的挑战。本论文从海洋生物实现水下附着的机理获得启发,以新发现的自组装藤壶胶蛋白cp19k为主体,结合贻贝Dopa化学,设计表达湿粘附性能进一步增强的纤维性融合蛋白;针对rBalcp19k蛋白在超声下极易发生降解的现象,研究了超声参数对rBalcp19k蛋白提取效果的影响,同时,结合溶菌酶预处理、蛋白酶抑制剂、自由基清除剂等的作用,进一步优化了超声提取的效果。此外,对高纯度的rBalcp19k蛋白进行了超声处理并表征了rBalcp19k在超声作用下结构与理化性质的变化,进一步研究了rBalcp19k的降解行为与超声处理之间的联系。本论文构建了2种重组质粒pET21a(+)-Balcp19k-Mefp5及p ET21a(+)-Mefp5-Balcp19k,并且成功表达出了融合蛋白Mefp5-Balcp19k。由于Mefp5-Balcp19k在纯化过程中发生了严重的降解行为,未能通过目前的纯化方法获得足量的且具有相当活性的蛋白。本论文发现超声功率、超声总时间、超声所用的容器以及宿主菌体的活性状态、添加蛋白酶抑制剂、自由基清除剂等均会影响rBalcp19k蛋白的提取效果;初步确定rBalcp19k蛋白在超声提取过程中极易发生降解现象是宿主菌体中相应的蛋白酶及超声过程中产生的·OH自由基的攻击破坏造成的。研究高纯度的rBalcp19k蛋白的超声效应,发现较低强度与较短时间的超声处理并不会改变其分子量的分布情况,即不会影响一级结构;随着强度和时间的增加,rBalcp19k发生了不规则降解,其分子量与浓度均明显降低。在长时间的超声处理下,rBalcp19k蛋白的二级结构发生了明显的变化且蛋白溶液趋于一种更稳定的状态;其聚集物的尺度大幅减小,变得更为均匀。此外,超声处理还会影响rBalcp19k在水性溶液中的聚集和解聚集行为。本论文在融合蛋白方面的工作能够为解决湿粘附难题提供新的思路,也能反过来推动海洋生物水下附着机理的研究;在超声效应方面的工作不仅在优化蛋白质超声提取工艺领域具有重要的借鉴价值,同时,在其他涉及超声技术的众多领域也存在着一定的参考意义。
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