论文部分内容阅读
猪水肿病(Edema disease, ED)是由产志贺毒素大肠杆菌(STEC)引起的以头部、肠系膜和胃壁浆液性水肿为特征的一种肠毒血症,常伴有共济失调、麻痹或惊厥等神经症状。本病多发生于断奶前后的仔猪,呈地方性流行和散发性,猪水肿病发病率虽然只有10%～30%,但致死率可高达80%～100%,是影响养猪业发展的重要传染病之随着猪场养殖规模的扩大和仔猪饲养密度的增加,猪水肿病日益严重,成为导致断奶仔猪死亡的重要传染病。本病的防治目前主要采取加强饲养管理及对病程稍长的仔猪对症治疗的综合性防治措施,但治愈率不高。由于本病的致死率高,所以疫苗免疫已成为防制本病的最经济的、有效的途径之一能引起猪水肿病的大肠杆菌称为产志贺毒素大肠杆菌(STEC), STEC有两类毒力因子：黏附素(adhesin)和志贺毒素(Stx)。黏附素包括菌毛、外膜蛋白(OMP)、紧密素(intimin)等。F18菌毛是STEC菌株的一个重要的毒力因子,它有助于细菌在猪肠黏膜上皮细胞定居和繁殖。而志贺毒素系STEC所产生的一种蛋白质性细胞毒素。STEC有多种血清型,常见的有O139：K82、O138：K81、O141：K85、O45、O8等。近年来有关STEC分离及鉴定的报道比较多,但疫苗研制的效果并不理想,目前还没有安全稳定、免疫效果确实的商品化疫苗被国家批准和面市。本课题以从中国兽医药品监察所引进的临床常见血清型的标准株为研究对象,旨在研发出免疫效果确实、应用范围较广的高效安全的商品化疫苗。我们引进的菌种为O138、O139、O141三个血清型的大肠杆菌C839O5、C83684、C83527的冻干菌种,首先,按照疫苗生产工艺和新兽药申报的有关要求,进行了菌种的纯粹性检验、菌体形态及培养特性观察、生化特性鉴定、血清型鉴定、毒力测定、免疫原性测定及稳定性测定等试验。结果表明此三株菌种均为革兰氏阴性菌,生化特性符合大肠杆菌的特性,菌种C83905株的菌体抗原血清型为O138,C83527株为O141、C83684株为O139；菌株对小鼠的最小致死量(MLD)分别为：C83905株3.6×108CFU,C83527株3.0×108CFU,C83684株2.0×108CFU；C83905、C83684、C83527三株菌的毒素对小鼠的最小致死量均为0.1mL/只,混合毒素为0.2mL/只；C83905、C83684、C83527三株菌毒素对14～18日龄仔猪的最小致死量分别为30mL、40mL、40mL,混合毒素的最小致死量为30mL/头；用三个菌株制备的灭活疫苗(灭活前含活菌数为3.0×108CFU/mL),分别以0.05mL/只免疫小鼠和以2mU头免疫14～18日龄仔猪,分别进行致死量的强毒菌和强毒菌毒素的攻击,均能达到80%～100%的保护率,充分表明了三株菌具有非常好的免疫原性。综上所述,引进的菌种具备了作为兽用生物制品菌种的基本条件。在此基础上,又对菌种的培养条件、灭活条件及疫苗佐剂选择进行了优化,如使用改良的LB培养基、以0.4%浓度甲醛37℃灭活48h和使用氢氧化铝胶作为佐剂等等,最终成功研制了仔猪水肿病三价(0138、0139、0141)灭活疫苗。根据实验结果,初步制定了仔猪水肿病灭活疫苗制造与检验试行规程和质量标准。通过对实验室试制的6批疫苗进行安全性试验、效力试验、最小免疫剂量测定及疫苗的免疫期试验和保存期试验等,表明了制备的疫苗具有良好的安全性和良好的保护力。安全性试验结果表明,用16-18g小鼠每只皮下注射0.3mL疫苗和用14日龄仔猪每头肌肉注射4mL疫苗均安全；最小免疫剂量试验表明,免疫小鼠能达50%以上保护的免疫剂量是0.01mL/只,免疫仔猪能达50%以上保护的免疫剂量1.0mL/头；此疫苗免疫小鼠能达100%以上保护的最小免疫剂量是0.05mL/只,免疫仔猪能达100%以上保护的最小免疫剂量1.5mL/头,为保证免疫效果确实,将此疫苗的使用剂量确定为2mL/头。经检验,该疫苗的甲醛、硫柳汞含量均符合制品的有关规定,免疫期至少可达3个月。此疫苗在2-8℃条件下保存到24个月,物理性状仍达到规程要求的标准,保存到18个月,效力仍能达到80%保护以上。另外,关于菌株毒力、疫苗安全性和保护性试验证明,对小鼠的使用剂量与对仔猪的使用剂量具有相关性,在实际生产中可用小鼠代替仔猪进行检验。根据实验室的试制情况,我们完善了仔猪水肿病灭活疫苗制造与检验试行规程和质量标准,并按照试行规程进行了中试生产,经检验,试制的6批疫苗经检验符合制定的质量标准。田间试验和扩大田间试验结果表明,实验室试制的6批疫苗,均具有良好的安全性和确实的效力,保护率达95%以上。中试疫苗在沈阳市、大连市、鞍山市、锦州市、铁岭市、辽阳市等地区免疫仔猪10万余头,均安全有效,总保护率达95%以上,对控制仔猪水肿病收到了满意的结果。以溶血性大肠杆菌C83905、C83684、C83527研制的仔猪水肿病灭活疫苗,按照新兽药申报的要求进行了注册申报,经过多次完善和补充试验,制备的三批样品,经中国兽医药品监察所进行质量标准复核检验,结果均达到制定的质量标准要求。该疫苗于2006年8月份率先获得农业部颁发的国家二类新兽药证书[证号：(2006)新兽药证字30号]