论文部分内容阅读
目的：人载脂蛋白E(apolipoprotein E，apoE)由299个氨基酸组成，分子量为34kDa，存在apoE2、apoE3、apoE4三种异构体。ApoEε4等位基因是阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)发病的一个风险因子，但是其增加AD发病风险的具体机制还不十分清楚。有研究表明，apoE蛋白的水解与AD发病相关，其水解产生的N-末端片段具有神经毒性作用，可诱导神经原纤维缠结形成；C-末端片段同淀粉样蛋白结合并参与老年斑的形成。因此确认在人脑组织内参与apoE水解并产生有病理意义片段的蛋白酶具有重要的意义。人体内水解apoE蛋白的酶类可能是天门冬氨酸蛋白酶。组织蛋白酶E是一种细胞内天门冬氨酸蛋白酶，研究提示此种蛋白酶在AD相关神经退行性变中起一定作用，因此组织蛋白酶E可能是人体内参与apoE水解的候选酶之一。本实验旨在通过体外实验观察重组人组织蛋白酶E(recombinant human Cathepsin E,rhCathepsin E)对重组人apoE(recombinant human apoE，rhapoE)蛋白水解作用的特点，为明确人脑组织内参与apoE水解的蛋白酶提供参考。为此，本研究具体观察了下列指标：1、组织蛋白酶E是否可以水解apoE2、apoE3、apoE4三种apoE异构体，水解产生的片段分子量大小是否相同，分子量大小是多少，以明确其水解方式是否具有异构体差异；2、在反应条件相同的情况下，组织蛋白酶E对apoE2、apoE3、apoE4水解程度的比较，以明确apoE被组织蛋白酶E水解的程度是否具有异构体差异性；3、以apoE4为例，观察在不同pH值条件下，组织蛋白酶E对apoE的水解活性，以明确组织蛋白酶E水解apoE的pH值范围。
方法：应用Western-blotting技术检测人重组组织蛋白酶E水解人重组apoE2、apoE3、apoE4的产物。步骤包括：1、组织蛋白酶E与组织蛋白酶E激活液混合，室温静置30min以激活其催化活性。2、配制组织蛋白酶E与apoE反应体系，分别为apoE水解产物异构体差异反应体系，apoE水解程度异构体差异反应体系及不同pH反应体系，反应条件为37℃水浴。3、对蛋白水解产物进行Western-blotting分析。4、应用Image Pro软件对图片进行分析。
结果：1、人重组组织蛋白酶E能水解人重组apoE2、apoE3、apoE4，生成分子量相同的apoE片段，大小约为25kDa、16.5kDa；2、组织蛋白酶E对apoE的水解程度具有异构体差异性，同apoE2及apoE4相比，在相同条件下，apoE3被组织蛋白酶E水解后产生较多的apoE片段；3、组织蛋白酶E虽为酸性蛋白酶，但在pH6.5、pH7.5条件下仍可水解apoE，产生apoE片段。
结论：人重组apoE2、apoE3、apoE4可被人重组组织蛋白酶E水解，结合以前的实验结果，初步证明组织蛋白酶E是人体内参与apoE水解的候选酶之一。