东方马脑炎病毒(Eastern Equine Encephalitis Virus, EEEV)和西方马脑炎病毒(Western Equine Encephalitis Virus, WEEV)能够引起人和某些动物发生传染性脑炎,该病具有传染性强、发病率和致死率高等特点,所以它们属于高危病原,已经引起国际高度重视,已被列为二类生物恐怖试剂。自从EEEV和WEEV被发现以来,已经给人类造成了巨大的经济损失。目前,市场上尚无有效EEEV和WEEV疫苗,用于预防EEEV和WEEV的疫苗主要采用灭活疫苗、弱毒疫苗和病毒活载体疫苗,但是,这些疫苗存在各自缺点,且它们不适用于人类。另外,EEEV和WEEV能够以气溶胶和蚊虫叮咬等方式传播,加上近年来生态环境的变化和国际间交流频率的增加给它们的传播提供了便利条件,使它们具有随时爆发的可能。因此,研制新型高效EEEV和WEEV的储备疫苗是预防和紧急应对它们爆发的有效手段。近几年,病毒样颗粒(Virus Like Particles, VLPs)作为新型疫苗已显示出安全性好和免疫原性强等优点,具有巨大的开发和应用潜力；另外,DNA疫苗已展示了它自身得天独厚的优势,对于多种疾病的预防和治疗具有广阔的应用前景。因此,本研究对EEEV和WEEV的病毒样颗粒疫苗和DNA疫苗进行了探索性研究,并建立了东、西方马脑炎假病毒中和试验的检测方法,以为EEEV和WEEV新型储备疫苗的研究提供重要参考。本研究主要分为五部分。第一部分：EEEV/WEEV假病毒中和试验的建立。为了有效评价抗体中和活性和避免自然病毒EEEV和WEEV作为中和试验所用的病原具有潜在的生物安全隐患,本研究首次利用HIV慢病毒包装系统和EEEV、WEEV的结构蛋白构建了这两种病毒的假病毒。假病毒鉴定结果显示获得的假病毒形态、结构与文献报道的EEEV、WEEV具有一致性,并且,假病毒感染抑制实验结果表明EEEV、WEEV假病毒的感染能力分别能被EEEV和WEEV的抗体所抑制,在此基础上,利用获得的假病毒分别建立了检测EEEV和WEEV抗体中和试验,检测结果表明该方法能够有效评价机体中抗体的中和作用。第二部分：EEEV病毒样颗粒疫苗的构建、鉴定与实验免疫研究。近些年,病毒样颗粒作为新型疫苗已展示了许多独特的优点,具有巨大的开发和应用前景。目前,EEEV的病毒样颗粒方面研究尚未见到报道,因此,本研究首次利用杆状病毒表达系统(Bac to Bac系统)通过基因重组技术构建了表达EEEV结构蛋白(C、E3、E2、6K和E1)的重组杆状病毒(BmNPV-C-E), BmNPV-C-E感染的家蚕细胞BmN可正确表达EEEV VLPs。免疫实验结果表明获得的EEEV VLPs免疫小鼠之后,VLPs能够有效诱导小鼠T淋巴细胞活化、刺激小鼠血清中产生高水平的细胞因子IL-2、IFN-γ、TNF-α和中和抗体；另外,VLPs能够刺激马淋巴细胞发生特异性地活化、增殖,并且,马血清中产生高水平的VLPs中和抗体,且具有较强的中和作用。因此,免疫结果表明EEEV VLPs能够有效刺激小鼠和马的细胞免疫和体液免疫活化,具有较强的免疫原性。第三部分：WEEV病毒样颗粒疫苗的构建、鉴定与实验免疫研究。目前,已有很多病毒样颗粒疫苗研制成功,但是,尚无WEEV病毒样颗粒疫苗的研究,因此,本研究首次利用Bac to Bac系统和WEEV结构基因(C、E3、E2、6K和E1)构建了重组杆状病毒(AcMNPV-C-E), AcMNPV-C-E能够在昆虫细胞SF9中正确表达WEEV VLPs,并且,制备的VLPs具有较强的免疫原性,能够刺激小鼠产生抗原特异性的IFN-γ+T细胞免疫反应,可诱导小鼠的脾细胞产生高水平的IL-2、IL-4、IFN-γ以及血清中产生高水平且具有中和作用的WEEV VLPs抗体；另外,VLPs能够诱导马淋巴细胞发生活化、增殖,产生细胞免疫,并且,马血清中产生高水平的VLPs中和抗体,产生较强的体液免疫。第四部分：东方马脑炎DNA疫苗的构建、鉴定与免疫原性研究。近年来,DNA疫苗是新兴发展起来的新型疫苗,与其它疫苗相比具有很多独特的优势,显示出了巨大的发展潜力,但是,目前,东方马脑炎DNA疫苗方面研究较少。因此,.本实验成功构建了重组表达载体pcDNA3.1-C-E-eeev,鉴定结果表明pcDNA3.1-C-E-eeev能在293T细胞中表达EEEV的E1和E2蛋白,并且,表达的蛋白能够包装成EEEV VLP且可释放到细胞外；另外,免疫实验表明pcDNA3.1-C-E-eeev具有较强的免疫原性,能诱导小鼠产生抗原特异性IFN-γ+T细胞免疫反应和抗原特异性CD4+T细胞产生IL-2、IL-4和IFN-γ免疫反应以及抗原特异性CD8+T细胞产生较强的IL-2和IFN-y免疫反应,并且,pcDNA3.1-C-E-eeev可诱导B淋巴细胞活化,产生高水平的中和抗体,并能够有效中和EEEV假病毒的感染。此外,免疫结果表明CpG与Poly(I:C)佐剂均可显著增强pcDNA3.1-C-E-eeev的免疫原性,其中,混合佐剂(CpG/Poly(I:C)应用产生的免疫增强作用要显著强于CpG或Poly(I:C)单独使用所产生的免疫效果,这表明不同佐剂的混合(CpG/Poly(I:C)或联合应用非常有望成为提高DNA疫苗免疫原性的一种新的有效方法。第五部分：西方马脑炎DNA疫苗的构建、鉴定与免疫原性研究。自从DNA疫苗被研究以来,已经展示出了很多自身特有的优点,具有巨大的研发潜力,但是,目前,西方马脑炎DNA疫苗的研究较少。因此,本研究利用真核表达载体pcDNA3.1和WEEV结构基因(C、E3、E2、6K和E1))构建了重组表达载体pcDNA3.1-C-E-weev,间接免疫荧光和电镜鉴定结果显示pcDNA3.1-C-E-weev能够在293T细胞中表达WEEV的E1蛋白和VLP,并且,表达的VLP可释放到细胞外；免疫实验结果显示pcDNA3.1-C-E-weev能够诱导小鼠T细胞活化和刺激小鼠产生高水平的细胞因子IL-2、IL-4、IFN-γ以及中和抗体,表明pcDNA3.1-C-E-weev能够有效诱导小鼠细胞免疫和体液免疫活化。终上所述,本研究结果表明,利用杆状病毒表达系统制备的EEEV和WEEV VLPs和构建的EEEV、WEEV的DNA疫苗均具有较强的免疫原性,具有作为疫苗的开发潜力。本研究结果为EEEV和WEEV新型储备疫苗奠定了良好基础。