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翻译是基因表达的关键过程之一,其效率对于生命活动十分重要。mRNA作为翻译体系的重要组成部分,在编码蛋白质的同时,对翻译速率起一定程度的调控作用。mRNA二级结构就是调控翻译速率的一种方式。研究mRNA二级结构对翻译速率的影响,有助于揭示翻译速率的调控机制,加深对二级结构及其调控机制进化的理解,将来可能用于生物技术领域提高转基因蛋白表达量的尝试。本研究从酿酒酵母S288c中利用聚合酶链式反应扩增ADP硫酸化酶(APA1)基因,与增强型荧光蛋白(EGFP)基因融合构建表达载体。以该载体为模板,通过一步法点突变技术向APA1基因中分别引入能改变该基因mRNA二级结构的同义突变,并转化酿酒酵母菌株YS59,检测荧光强度,研究mRNA二级结构与翻译速率的关系。主要研究结果如下:1.将APA1基因与EGFP基因融合,酶切质粒pY16TEF1后用连接酶连接并转化,酶切和测序结果表明成功构建了表达载体pY16TEF1-EGFP-APA1,并转化酿酒酵母YS59,对数期细胞镜检,荧光显微镜下可见绿色激发荧光,表明APA1与EGFP基因共表达。2.利用一步法点突变技术,通过含有突变的引物,向表达载体pY16TEF1-EGFP-APA1引入18个同义突变,这些突变可以改变基因APA1预测的mRNA折叠能。测序结果与数据库中已有的序列比对表明,这些突变位置和目标位置一致,符合预期。一步法点突变技术方法简单,能高效引入突变。转化酿酒酵母YS59后,荧光显微镜下可见激发荧光,证明这些同义突变基因能够表达。3.培养同义突变转化子,取对数期细胞,利用流式细胞仪检测其荧光强度。结果表明无论预测的结构是靠近翻译起始区还是靠近翻译终止区,mRNA二级结构的改变均能够影响蛋白质的翻译效率,二级结构对于延伸阶段也有影响。破坏二级结构稳定性后,一定程度上能增强翻译效率。但是,并不是所有的同义突变都能呈现一致的规律。有的突变,其相应的荧光强度变化不大,甚至出现了下降,说明二级结构对于翻译速率的影响,规律比较复杂。同时,有些预测不显著改变mRNA结构稳定性的同义突变,其荧光强度却发生了明显的变化,这可能是存在某种其他未知因素,影响蛋白质翻译速率。