随着茶产业的迅速发展,其副产物茶渣的处理和再利用成为研究热点,而影响茶渣再利用的成分是咖啡因。传统物理化学方法脱除咖啡因有很大弊端,例如化学药品残留、费时费力、资金投入大、污染环境等,而利用微生物来降解咖啡因就摒除了以上弊端。本论文以实验室前期筛选的Paraburkholderia caffeinilytica CF1(下文简称CF1)为研究对象,该菌株具有耐受高浓度咖啡因的能力,并可以咖啡因为唯一碳氮源生长。本研究采用高通量测序技术对该菌株进行差异转录组测序,以期获得在咖啡因胁迫下菌株中与咖啡因降解直接相关的功能基因,并对这些基因表达产物进行功能分析。本研究对发掘咖啡因降解菌的酶系及功能基因资源,为今后研究表达因子以及胁迫应激蛋白参与细胞抵御降解咖啡因的机理奠定基础;为研制咖啡因降解工程菌制剂,提高茶渣的利用效率具有实际的指导意义。本论文的研究内容如下:对CF1菌株进行差异转录组测序,包括两个转录本(包括实验组和对照组);获得显著上调序列123条,显著下调序列2669条(FDR≤0.001 AND |log2Ratiol≥1),其中Unigene14_All(log2 Ratio=8.4)和 Unigene1922_All(log2 Ratio=9.7)为本文研究的内容。对这两个差异序列进行了 GO和Pathway的显著性富集分析,功能注释分别为甲基黄嘌呤N1脱甲基酶和甲基黄嘌呤N7脱甲基酶。通过qRT-PCR检测cdnA、cdnC在实验组和对照组中的表达量,检测结果与差异转录组测序结果一致。以Unigenel4_All和Unigene1922_All序列为参考序列,借助NCBI数据库相似菌株序列,通过特异设计特异引物,获得甲基黄嘌呤N1脱甲基酶cdnA和N7脱甲基酶cdnC基因全长。分别通过Rostta-gami-pLysS-pET32a-cdnA和Rostta-gami-pLysS-pET32a-cdnC体系,成功表达CdnA和CdnC目标蛋白。分别以咖啡因、1,3-二甲基黄嘌呤和1,7-二甲基黄嘌呤和1-甲基黄嘌呤为底物时,检测到CdnA在CdnD存在下具有N1位脱甲基酶活性。