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1、研究背景肿瘤转移是一个极为复杂的、多步骤的细胞生物学过程,也称为侵袭-转移级联进程,在这个过程中原发性肿瘤细胞获得侵袭能力,然后扩散到远处器官。包括乳腺癌在内的多种实体恶性肿瘤中,90%以上的癌症相关死亡是由转移所引发的。虽然早期诊断、手术切除和辅助治疗方案都有所改善,但转移性疾病在很大程度上仍旧是无法治愈的。随着肿瘤干细胞学说的兴起,我们对肿瘤干细胞的认知越来越深刻,肿瘤干细胞即为肿瘤中极其少数的一群具有自我更新及多向分化潜能的细胞群体,与临床肿瘤患者的转移、复发和治疗抵抗密切相关。所以,肿瘤干细胞的干性特征与肿瘤转移表型之间存在着千丝万缕的联系。最近的研究表明,驱动肿瘤细胞发生侵袭、转移的主要原因是细胞获得遗传或表观遗传学上的改变。因此,探索调控肿瘤转移及肿瘤干细胞干性的关键分子机制就显的极为关键和迫切。信号衔接蛋白p62（SQSTM1）最初被鉴定作为一种细胞质内的62kDa蛋白,可与p56lck的SH2结构域结合。p62这种多结构域多功能蛋白可以选择性的与Raptor、Keap1、Ubiquitin、LC3等不同信号媒介相互作用,分别调控细胞代谢、氧化应激反应和选择性自噬等过程。在人类多种恶性肿瘤中均存在p62异常累积,特别是乳腺癌。p62的异常增多与侵袭性乳腺癌的临床病理特征及EGF受体（EGFR）、HER2、HER3和HER4的过表达均有着一定的关联。在三阴性乳腺癌患者群体中,p62富集的患者存在着较高的淋巴结转移和淋巴管浸润的风险。我们课题组的前期研究结果揭示,p62信号蛋白对乳腺癌干细胞的表型特征具有重要的调控作用,靶向该蛋白能够有效抑制乳腺癌干细胞的干性特征。这些发现强调了p62作为临床肿瘤治疗靶点的潜力,然而,p62介导肿瘤细胞侵袭转移的具体机制仍不清楚。针对上皮来源的恶性肿瘤的研究表明,早期肿瘤细胞获得侵袭和转移的能力主要取决于上皮向间充质表型的转变。vimentin作为Ⅲ型中间丝蛋白,是一种经典的间质表型的生物标志物。研究指出,vimentin蛋白过表达与细胞运动、EMT诱导、转移性疾病及临床不良预后呈正相关。vimentin缺陷的小鼠由于成纤维细胞迁移能力严重受损,导致其生长各阶段的伤口愈合能力均减弱。在本研究中,我们发现p62与vimentin蛋白之间相互结合并且p62能够促进vimentin蛋白的表达,进而强化肿瘤细胞的侵袭和转移能力。因此,这种p62-vimentin蛋白之间的相互作用可能成为一个有潜力的靶点,为转移性肿瘤的治疗提供新的干预方案。2、研究方法（1）（1）收集5对临床转移性乳腺癌患者癌及癌旁正常组织的标本,制备蛋白样品,采用Western blot方法检测目的蛋白的表达情况;（2）分析TCGA数据库中正常乳腺组织、原位癌和转移性乳腺癌患者组织中目的基因的表达情况;（3）利用Kaplan-Meier生存分析,评价目的基因与临床乳腺癌患者预后的关系。（2）（1）构建敲降或过表达所研究的目的基因的稳定细胞系;（2）利用微流控芯片模型,研究目的基因对肿瘤细胞侵袭能力的影响。（3）体内实验:（1）斑马鱼胚胎异种移植实验,验证目的基因对细胞侵袭行为的影响;（2）裸鼠尾静脉注射不同处理组乳腺癌细胞系,验证目的基因对乳腺癌肺转移的影响;（3）通过裸鼠皮下成瘤实验,验证目的基因对肿瘤发生的影响（每组5只）,培养8周后比较各组的肿瘤体积和肿瘤重量。（4）（1）利用蛋白免疫共沉淀联合质谱方法,分析能够与目的蛋白结合的蛋白质;（2）蛋白免疫共沉淀方法验证内源性不同蛋白之间的相互作用（目的蛋白与上述新发现的蛋白）;（3）蛋白免疫共沉淀方法验证外源标签标记的不同蛋白之间的相互作用;（4）通过细胞免疫荧光实验,验证目的蛋白与上述新发现蛋白在细胞内的共定位情况;（5）采用Western blot检测目的蛋白对上述新发现蛋白表达的影响;采用RT-qPCR检测目的基因对上述新发现蛋白相应mRNA表达的影响。（5）（1）在敲降目的基因的细胞中过表达靶标蛋白,同时也在过表达目的基因的细胞中敲降靶标蛋白,Western blot检测不同处理组各个蛋白的表达效率;（2）利用微流控芯片模型,验证上述各处理方案对肿瘤细胞侵袭能力的影响;（3）Transwell实验检测上述各处理方案对肿瘤细胞侵袭能力的影响。（6）（1）收集10例临床乳腺癌组织标本,Western blot检测目的蛋白和靶标蛋白的表达水平;（2）将上述目的蛋白和靶标蛋白的相对表达水平做线性回归分析。3、研究结果（1）p62在转移性乳腺癌标本中的表达情况及p62过表达与转移性乳腺癌临床预后的相关性研究结果:（1）Western blot结果显示,相比于正常组织,转移性乳腺癌组织中p62的表达量明显更高;（2）TCGA基因表达值分析显示,正常组织（n=110）中p62的mRNA表达水平明显低于原发肿瘤（n=1065;-0.4355 vs-0.1485）和转移瘤组织（n=7;-0.4355 vs-0.1423）;（3）针对乳腺癌标本的Kaplan-Meier生存分析显示,p62表达升高与患者生存期减少相关（GSE6532,GSE42568）。（2）体外细胞学研究结果:（1）Western blot结果显示,在MDA-MB-231细胞中用两种不同的shRNA干预p62,都产生明显抑制效果;将MCF-10A细胞感染含p62基因的病毒,p62在细胞内稳定过表达;（2）微流控芯片结果显示,沉默p62表达可显著降低乳腺癌MDA-MB-231细胞的侵袭能力;高表达p62可增加MCF-10A细胞的侵袭能力。（3）体内功能学研究结果:（1）在斑马鱼胚胎异种移植实验中,我们将稳定表达红色荧光蛋白的MCF-7 siNC和MCF-7 sip62细胞移植到斑马鱼胚胎宿主中,植入3天后,在MCF-7细胞中沉默p62表达组与对照组相比,细胞侵袭行为明显降低;并且相比于对照组,p62 siRNA MCF-7细胞移植斑马鱼胚胎转移发生率较低（实验组:20/90,22.2%;对照组:49/111,44.1%）;对侵袭性细胞荧光强度的定量分析显示,p62的下调导致细胞荧光强度显著降低;（2）裸鼠尾静脉注射不同处理组乳腺癌细胞,8周后取肺组织,经大体及H&E染色观察到,p62敲降组MDA-MB-231细胞肺转移明显减少;统计显示p62干预组与对照组相比,小鼠肺转移结节灶面积和数量均显著减少;（3）裸鼠皮下成瘤结果显示,p62敲降组MDA-MB-231细胞成瘤体积和重量均小于对照组,肿瘤生长速率更慢。（4）（1）蛋白免疫共沉淀联合质谱分析,显示p62所结合的蛋白情况;（2）蛋白免疫共沉淀结果证实,内源性p62与vimentin蛋白发生相互结合;（3）蛋白免疫共沉淀结果证实,外源性带标签的p62和vimentin蛋白也可以相互结合,具体表现为GST标记的p62可以结合His标记的vimentin,同理,GST-vimentin也能够结合Flag-p62;（4）细胞免疫荧光结果显示,p62蛋白与vimentin蛋白在细胞质内发生共定位;（5）在SK-BR-3细胞中瞬时敲降p62,发现细胞内vimentin蛋白表达下调,但vimentin的mRNA水平没有变化,同理,在MDA-MB-231细胞中抑制p62表达后,也检测到vimentin蛋白水平的下调,而其mRNA水平未见变化;在MCF-7和MCF-10A细胞中同时过表达p62,能够上调vimentin蛋白的表达,但对vimentin mRNA的表达均不产生影响。（5）（1）Western blot结果显示,vimentin在shNC/shp62细胞中的过表达及在Ctrl/p62-OE细胞中的敲降均起作用;（2）微流控芯片结果表明,vimentin在MDA-MB-231-shp62细胞中的人为外源性过表达,可解除因p62缺失所导致的细胞侵袭能力的降低;而MDA-MB-231-p62-OE细胞中vimentin蛋白的下调,可减弱因p62过表达所导致的增强的细胞侵袭能力;（3）Transwell实验结果表明,vimentin在MDA-MB-231-shp62细胞中的人为外源过表达,可废除因p62缺失所导致的细胞侵袭能力的降低;而MDA-MB-231-p62-OE细胞中vimentin蛋白的下调,可减弱因p62过表达所导致的增强的细胞侵袭能力。（6）（1）Western blot结果显示,vimentin蛋白在乳腺癌组织标本中的表达水平相对较高,p62的表达更为丰富;（2）线性回归分析显示,p62与vimentin蛋白表达呈正相关（R2=0.7539,P=0.0011）。4、研究结论（1）p62在转移性乳腺癌中表达升高,其过表达与临床不良预后相关;（2）p62促进乳腺癌侵袭转移;（3）p62结合vimentin并促进vimentin蛋白表达;（4）vimentin在p62介导的乳腺癌转移中发挥重要作用;（5）临床乳腺癌标本中,p62与vimentin蛋白表达呈正相关。