结肠癌是全球第三大常见癌症,也是全球第二大死亡癌症。每年约有120万结肠癌的新病例,同时也有70万人死于结肠癌。结肠癌的发生是由结肠粘膜细胞中基因突变和表观突变的积累最终导致细胞无限增殖。因此,研究结肠癌形成的的分子机制有助于我们进一步对癌症的预防和治疗,更好的为人类健康服务。p21是细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子1A（CDKN1A）,它能介导p53依赖性细胞周期各个阶段的生长停滞。p21蛋白结合并抑制细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶（Cyclin dependent kinases,CDKs）/细胞周期蛋白（Cyclins）复合体的活性,负调控细胞周期进展,进而抑制了肿瘤细胞的增殖。p21是主要的细胞周期检查点抑制因子,而且p21的下调导致许多肿瘤的生长如乳腺癌、鼻咽癌和肝癌等。然而与在约50%肿瘤中发生突变的p53不同,p21在人类肿瘤中是很少发生突变的。NeuroD1（神经分化因子1）是bHLH（basic helix-loop-helix）型转录因子,通过与启动子中的E-box结合,介导转录激活作用调控神经元的生成,并且能够在Xenopus胚胎中将胚胎表皮细胞转化为完全分化的神经元,并促进神经前体细胞分化。有研究发现NeuroD1参与神经母细胞瘤的肿瘤发生,并且在MYCN转基因小鼠中神经母细胞瘤细胞系建立的肿瘤球的生长受到NeuroD1的调控。然而NeuroD1在结肠癌发生发展中的作用机制尚未完全明确。本次研究中,我们发现NeuroD1在结肠癌病人组织中呈现一个高表达的趋势,而且NeuroD1的敲减对肿瘤细胞的增殖起到了一个抑制的作用。在野生型结肠癌细胞中,p21荧光素酶报告基因结果显示,敲减NeuroD1后p21的转录活性明显上升。实时定量PCR和Western Blot结果发现敲减NeuroD1后,细胞周期调控因子p21的mRNA和蛋白表达明显上升。相反,当过表达NeuroD1后,p21的mRNA和蛋白的表达水平则显著下降。随后我们考察了NeuroD1对肿瘤细胞增殖能力的调控,结果显示NeuroD1敲减抑制了肿瘤细胞的增殖和集落形成能力。我们也利用碘化丙叮将细胞进行染色并利用流式细胞仪进行细胞周期分析,发现NeuroD1的敲减没有引起细胞凋亡的明显变化,而对细胞周期产生了影响,发生了G₂/M期细胞周期阻滞,抑制了Cyclin-B和Cdc2的蛋白表达。这些结果提示了NeuroD1通过负调控p21的表达从而影响了肿瘤细胞周期进程及细胞增殖。p53基因是肿瘤发展过程重要的抑癌基因,当细胞发生DNA损伤会导致p53的表达水平上升。在本次研究中我们发现,敲减NeuroD1导致p53的mRNA和蛋白质表达量明显上升。我们利用双荧光素酶报告基因检测发现,NeuroD1的敲减使p53报告基因的活性上升,说明NeuroD1可能是通过调控p53的转录活性进而调控p21的表达。随后我们通过染色质免疫共沉淀（ChIP）实验发现NeuroD1蛋白质能直接结合p53的启动子区域;并通过预测p53启动子中NeuroD1的识别序列和对p53启动子进行点变异,确定NeuroD1蛋白质在p53启动子的特异性识别序列CAGATT。根据以上实验结果,本课题研究初步发现NeuroD1通过直接调控p53的转录活性进而抑制p21的表达水平,促进结肠癌细胞周期进程,最终促进结肠癌细胞增值和克隆形成。本研究不仅提供了有关NeuroD1癌生物学功能的新见解,同时也为阐明NeuroD1在结肠癌发生发展中的作用机制的后续研究提供了重要前期实验依据。