低温胁迫是花卉栽培常见的一种灾害,是影响花卉生产质量的重要因素之一;同时,激素参与花卉生长发育以及低温、干旱、盐胁迫等非生物胁迫的响应机制,为花卉提供抗逆性。对花卉抗性的研究是科研服务于生产的需要,因此研究花卉的抗性机制,掌握低温胁迫及激素处理下基因表达变化规律,对于提高花卉的生产质量、选育抗性新品种等方面具有十分重要的意义。因此,耐冷性强,抗旱性强的毛百合(Lilium dauricum),同时也是作为园林杂交育种的重要野生资源,探究其具体的抗性机制是十分必要的。在本课题组早期研究基础上,选取毛百合LpGPAT基因作为探究百合抗性机制的目的基因。本研究利用生物信息学分析对毛百合LpGPAT氨基酸序列9个其他物种的同源质体GPAT氨基酸序列及拟南芥中10个GPAT氨基酸序列进行系统发育进化树构建,对LpGPAT与同源GPAT进行氨基酸序列比对,分析蛋白在保守结构域的差异,以此探究GPAT蛋白结构与功能的关系。运用实时荧光定量技术分析在低温和不同激素(50μM脱落酸、100μM水杨酸、50μM乙烯利、10μM茉莉酸甲酯)诱导下,LpGPAT基因在毛百合叶片的转录表达水平。同时根据LpGPAT基因启动子上顺式作用元件的前期预测结果,构建4个不同启动子缺失片段的瞬时表达载体,通过农杆菌介导进行烟草转化,并在低温和激素胁迫后,对GUS蛋白进行定性和定量检测,以确定预测的顺式作用元件是否能响应低温和激素信号,在LpGPAT基因转录过程中的作用。最后,构建1302-LpGPAT-GFP亚细胞定位载体进行亚细胞定位试验,明确LpGPAT蛋白的位置,了解蛋白质的性质和功能,对进一步研究蛋白质之间的互作具有重要意义。本研究主要结果如下:1.LpGPAT蛋白和其它植物的GPAT蛋白同样具有保守性强的酰基转移酶活性结构域(PlsC):BOX I,BOX II,BOX III和BOX IV,表明LpGPAT蛋白属于酰基转移酶家族成员,具有酰基转移酶的活性。LpGPAT蛋白与拟南芥质体GPAT(ATS1)蛋白在系统发育进化树中被聚类到同一进化支中,因此可以推测LpGPAT同ATS1一样定位于质体上。2.在低温胁迫下毛百合LpGPAT基因迅速表达,且在长时间的低温处理下持续表达,这将导致毛百合叶片中TAG的代谢,从而提高毛百合对低温抗性。在不同激素诱导下,LpGPAT能够响应多种植物激素的诱导,这将帮助毛百合对非生物胁迫的抗逆性,也为研究LpGPAT的功能提供了重要理论参考。3.LpGPAT基因启动子上存在多种低温和激素应答顺式作用元件,根据顺式作用元件的分布位置采用启动子5’端缺失法构建4个启动子缺失植物表达载体(G1-G4),并通过农杆菌介导转化本氏烟草进行瞬时表达分析试验。在正常条件下,LpGPAT启动子启动下游GUS蛋白的能力较弱,且G1>G2>G3>G4;在低温和不同激素诱导下,含有不同顺式作用元件的LpGPAT启动子对GUS报告基因的转录活性存在差异,但启动下游GUS蛋白的能力明显比正常条件强。说明LpGPAT启动子受低温和激素的诱导,在非生物胁迫时LpGPAT转录活性增强,以此来应对逆境。4.LpGPAT基因编码蛋白定位于细胞膜和叶绿体。