第一部分 多囊卵巢综合征患者肠道菌群和粪便脂肪酸的研究引言:多囊卵巢综合征（Polycystic ovary syndrome,PCOS）是育龄期女性常见的一种内分泌代谢异常综合性疾病,以稀发排卵或无排卵、高雄激素或胰岛素抵抗为特征,其典型的临床表现为月经异常、不孕、多毛、痤疮、肥胖。因其症状的高度异质性、病因复杂性,至今发病机制仍不完全清楚,对其预防和长期控制仍不理想。近年来,肠道菌群与代谢性疾病的研究成为热点。PCOS作为一种复杂的内分泌代谢综合征,与胰岛素抵抗、慢性炎症、代谢综合征等密切相关,那么PCOS是否与肠道菌群相关,其特征性变化如何?PCOS患者中肠道菌群的代谢产物粪便脂肪酸的变化如何?目的:1.阐明PCOS患者肠道微生态变化特征,分析肠道菌群变化与PCOS临床特征的相关性;2.鉴定PCOS患者粪便脂肪酸代谢特征,分析肠道菌群和短链脂肪酸的相关性。研究方法:1.纳入符合标准的PCOS患者31例（PCOS组）,健康女性27例（对照组）。记录年龄、身高、体重、身体质量指数（Body mass index,BMI）、多毛评分、痤疮评分、腰围、臀围、腰臀比（Waist hip rate,WHR）、月经周期、彩超。同时PCOS组根据BMI值分为两组,即:PCOSF组（BMI≥ 24 kg/m2,N=12）和PCOST 组（BMI＜24kg/m2,N=19）。2.检测总睾酮（Total testosterone,TT）、性激素结合球蛋白（Sex hormone binding globulin,SHBG）、双氢睾酮（Double hydrogen testosterone,DHT）、游离睾酮（Free testosterone,FT）、空腹胰岛素（Fasting insulin,FINS）以及空腹血糖（Fasting blood glucose,FBG）等临床指标。3.血清炎症指标:应用酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测血清内白细胞介素-6（Interleukin 6,IL-6）、肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor alpha,TNF-α）、脂多糖结合蛋白（Lipopolysaccharide-bindingproteins,LBP）含量。4.肠道通透性指标:应用ELISA法检测血清二胺氧化酶（Diamine oxidase,DAO）含量。应用D-乳酸比色试剂盒检测血清内D-乳酸含量。5.16S rRNA测序及生物信息学分析:使用粪便基因组DNA提取试剂盒提取粪便样本中的DNA,依次完成PCR扩增、DNAMiseq文库构建,高通量测序等;对测序结果进行生物信息学分析,包括物种注释及评估、多样性分析、物种组成分析、样本比较分析、物种差异分析、Pearson相关性Heatmap分析、肠道菌群功能预测分析等。6.气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）检测粪便脂肪酸:提取粪便样本中的脂肪酸,采用GC-MS检测分析粪便中乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸和癸酸共1 1种代谢物的生成量,对PCOS组和Control组中代谢物进行差异性分析。结果:1.与对照组相比,PCOS患者多毛症状、痤疮、DHT水平、FT水平、FINS、FBG和TNF-α含量明显升高（P＜0.05）。2.PCOS组血清D-乳酸含量高于对照组（P＜0.05）。3.PCOS组与对照组的肠道菌群多样性和群落的空间分布无显著差异;在群落组成方面上,PCOS组和对照组肠道菌群中的消化链球菌科（Peptostreptococcacese）和拟杆菌科（Bacteroidales S24-7group）存在显著性差异（P＜0.05）。基于线性判别分析（LDA）选择,克雷伯氏菌科（Klebsiella）、肠杆菌科（Enterobacteriaceae）和γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria）等14个菌群在PCOS组中占优势,而瘤胃球菌属（Ruminocaccaceae UCG 013）和普雷沃氏菌属（Prevotellaceae UCG 001）等3个菌属在对照组中占优势。4.PCOSF组和PCOST组的肠道菌群多样性及群落空间分布无显著差异;与PCOST组相比,杆菌纲（Bacilli）、乳酸杆菌目（Lactobacillales）、消化链球菌科（Peptostreptococcacese）和韦永氏球菌科（Vellonellaceae）在PCOSF组中显著升高,而布劳特氏菌属（Blautia）在PCOSF组中显著降低（P＜0.05）。基于LDA选择,韦永氏球菌科（Vellonellaceae）、乳酸杆菌目（Lactobacillales）和消化链球菌科（Peptostreptococcaceae）等13个菌群在PCOSF组中占优势,而韧皮部杆菌属（Candidatus Soleaferrea）、真杆菌属（Eubacterium hallii group）和丹毒梭菌属（Erysipelatoclostridium）等4个菌属在PCOST中占优势。5.痤疮评分、FT和FINS与巨噬单胞菌属（Megamonas）呈正相关,FT和考拉杆菌属（Phascolarctobacterium）负相关。6.PCOS患者粪便中乙酸和丙酸的含量明显高于对照组（P＜0.05）,巨球形菌属（Megasphaera）、考拉杆菌属（Phascolarctobacterium）和毛螺菌属（Lachnospira）可能是两组脂肪酸代谢差异的主要菌属。结论:1.PCOS患者肠道菌群结构发生变化,并与雄激素、BMI等多项临床指标存在相关性,肠道菌群同雄激素和血糖代谢可能存在相互调节关系。2.PCOS患者肠道通透性可能增加。第二部分 多囊卵巢综合征大鼠模型肠道菌群、粪便脂肪酸和肠道屏障的改变目的:1.建立PCOS大鼠的动物模型;2.鉴定PCOS模型大鼠肠道菌群特征和粪便脂肪酸的改变;3.分析PCOS模型大鼠肠道屏障功能的改变,及其与肠道菌群变化的互作关系。研究方法:1.PCOS大鼠模型的构建:选取6周龄SD雌性大鼠18只,随机平均分为PCOS模型组和对照组。PCOS模型组给大鼠灌胃服用溶解于羧甲基纤维素溶液的来曲唑（1 mg/kg.d）,连续3周;对照组灌胃等剂量的羧甲基纤维素溶液。分别在造模0周、1周、2周和3周采集血液和粪便样本,冻存。收集大鼠卵巢、小肠和结肠组织进行病理学检测。每天记录大鼠体重变化、阴道分泌物巴氏图片观察动情周期。2.血清炎症指标检测:应用ELISA法检测0周、1周、2周和3周大鼠血清IL-6、TNF-α和脂多糖（LPS）含量。3大鼠卵巢采用苏木精-伊红染色观察组织形态学变化。5.粪便菌群采用16S rRNA测序及生物信息学分析。动态分析两组在造模后0周、1周、2周和3周时肠道菌群的组成和结构差异。6.应用气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）检测大鼠粪便脂肪酸含量。7.肠道屏障功能检测:Western Blot检测两组大鼠小肠和结肠组织中紧密连接蛋白Occludin和Zonula occludens-1（ZO-1）的表达量,实时荧光定量PCR（qPCR）检测结肠Occludin和ZO-1的mRNA表达水平,免疫组化法检测结肠中Occludin和ZO-1的蛋白表达水平。结果:1.PCOS模型组动情周期消失,胰岛素和睾酮高于对照组（P＜0.05）,HE染色卵巢出现多囊性改变,表明PCOS模型构建成功。2.血清炎症因子:PCOS模型组大鼠血清中TNF-α、IL-6和LPS表达量明显增加。3.肠道菌群分析结果:0周、1周、2周和3周模型大鼠粪便样本的微生物多样性无显著差异;但0周、1周、2周和3周的大鼠粪便菌群群落空间分布均存在显著偏离。随着PCOS大鼠造模时间的延长,疣微菌门（Verrucomicrobiota）、弯曲杆菌门（Campilobacterota）和艾克曼菌属（Akkermansia）等11个菌群的丰度逐渐降低,而惰性真杆菌属（Eubacterium siraeum group）、罗氏菌属（Rothia）和微球菌目（Micrococcales）等5个菌群的丰度逐渐升高。PCOS模型组大鼠与对照组的肠道微生物多样性无显著差异,但其及群落空间分布存在显著差异。与对照组大鼠相比,PCOS模型大鼠肠道中疣微菌门、疣微菌纲的丰度显著降低。基于 LDA 选择,包括Anaerostipes、Eisenbergiella 和真细菌目（Eubacteriales）在内的8个细菌类群在 PCOS模型组中占优势,而包括疣微菌门（Verrucomicrobiota）、艾克曼菌属（Akkermansia）和Atopobiaceae在内的8个细菌类群在对照组中占优势。4.与对照组大鼠相比,PCOS模型组大鼠肠道中乙酸的生成量明显减少（P＜0.05）,而丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸和己酸的含量无明显变化。5.肠道屏障功能:Western Blot结果显示PCOS模型组大鼠结肠组织中Occludin和ZO-1蛋白表达较对照组降低（P＜0.05）。qPCR结果显示PCOS模型大鼠结肠组织中Occludin和ZO-1 mRNA的表达较对照组降低（P＜0.05）。免疫组化的检测结果显示PCOS模型组大鼠小肠和结肠Occludin蛋白表达较对照组降低。结论:1.PCOS模型大鼠的肠道菌群组成和分布发生明显改变。疣微菌门（Verrucomicrobiota）、弯曲杆菌门（Campilobacterota）和艾克曼菌属（Akkermansia）的丰度降低在PCOS的发生发展过程中起重要作用。2.PCOS模型大鼠通过抑制肠黏膜紧密连接蛋白的表达引起肠道屏障功能损伤。第三部分 基于肠道菌群和肠道屏障功能探究小檗碱治疗多囊卵巢综合征大鼠的作用及其机制引言:小檗碱是存在于黄连、黄柏等药材中的主要生物碱,临床上口服小檗碱长期用于抗肠道细菌感染,近年来动物实验及临床研究证实,小檗碱对PCOS有治疗效果,但其作用机制不明。药理学研究发现,小檗碱口服生物利用度很低,基本不被吸收入血。因此,我们推测小檗碱可能通过调节肠道菌群,改变肠黏膜屏障,降低内毒素血症和全身低度炎症反应发挥作用。目的:1.验证小檗碱对PCOS模型大鼠的治疗作用。2.探索小檗碱对肠道菌群的影响,鉴定发挥关键作用的肠道微生物。3.分析小檗碱对肠道上皮屏障功能的作用及其作用靶点。研究方法:1.PCOS模型大鼠的建立和实验设计:选用6周龄的SD大鼠36只,其中9只作为空白对照组（Blank control,BC组）,持续应用0.5%的羧甲基纤维素钠溶液灌胃。其余27只大鼠采用来曲唑（1 mg/kg.d）灌胃3周后,随机分为模型对照组（Model control,MC组）、小檗碱组（Berberine,BB组）和二甲双胍组（Metformin,M组）。MC组继续使用0.5%羧甲基纤维素钠溶液灌胃2周,BB组使用小檗碱（150mg/kg.d）灌胃2周,M组使用二甲双胍（200mg/kg.d）灌胃2周。按照严格的时间点,处死大鼠,收集大鼠血液、卵巢、小肠和结肠组织。每天记录大鼠的体重变化、收集阴道分泌物做巴氏图片观察动情周期。2.应用ELISA法检测各组大鼠血清胰岛素、睾酮、IL-6、TNF-α和LPS含量。3.各组大鼠卵巢采用HE染色观察组织形态学变化。4.粪便菌群采用16S rRNA测序及生物信息学分析。分析BC组、MC组和BB组肠道菌群组成和结构差异。5.应用GC-MS法检测大鼠粪便脂肪酸含量。6.肠道屏障功能检测:分别采用Western Blot法、qPCR法和免疫组化法检测BC组、MC组和BB组小肠和结肠组织中Occludin和ZO-1的蛋白表达量和mRNA表达水平。7.Toll like receptor（TLR）信号通路检测:分别采用 Western Blot 法和 qPCR法检测BC组、MC组和BB组大鼠结肠组织中TLR-4、MyD88及NF-κB p65的蛋白表达量和mRNA表达量。结果:1.BB组和M组对PCOS模型大鼠的影响:与MC组和BB对照组相比,BB组和M组大鼠体重降低,动情周期恢复（4-5天）,而MC组大鼠动情周期延长（7-8天）或呈现无规律的动情周期。与MC组相比,BB组和M组大鼠血清空腹胰岛素和睾酮水平降低（P＜0.05）;BB组和M组大鼠卵巢HE染色显示卵巢多囊样改变消失。2.血清炎症指标:与MC组大鼠相比,BB组和M组大鼠血清TNF-α、IL-6和LPS显著降低（P＜0.05）。3.小檗碱对PCOS大鼠肠道菌群的影响:BB组、MC组和BC组大鼠肠道微生物的多样性无显著差异,但其群落空间分布存在显著偏离。包括丹毒丝菌科（Erysipelotrichaceae）、消化链球菌科（Peptostreptococcaceae）和颤螺菌科（Osrillospiraceae）在内的8个细菌科的丰度在BB组明显低于BC组和MC组,而拟杆菌科（Bacteroidaceae）、艾克曼菌科（Akkermansiaceae）和真细菌科（Enterobacteriaceae）的丰度在BB组显著高于BC组和MC组。基于LDA选择,包括拟杆菌属（Bacteroides）、艾克曼菌属（Akkermansia）和嗜胆菌属（Bilophila）在内的27个细菌属在BB组中占优势。4.小檗碱对PCOS大鼠粪便脂肪酸的影响:与MC组相比,BB组粪便中乙酸和丙酸明显增加（P＜0.05）,丁酸、戊酸和己酸的含量降低（P＜0.05）,异丁酸和异戊酸无显著差异（P＞0.05）。5.Western Blot结果显示,BB组大鼠结肠组织中2种相关蛋白Occludin和ZO-1的表达量较MC组显著升高（P＜0.05）。qPCR结果显示,与MC组相比较,BB组大鼠结肠组织Occludin和ZO-1 mRNA的表达显著升高（P＜0.05）。小肠和结肠的免疫组化结果显示,BB组大鼠结肠组织中的Occludin蛋白表达较MC组升高（P＜0.05）。6.TLR信号通路检测,Western Blot结果显示:与MC组相比,BB组大鼠结肠组织中TLR-4、MyD88及NF-κB p65的蛋白表达量明显降低;qPCR结果显示:与MC组相比,BB组大鼠结肠组织中TLR-4、MyD88及NF-κB p65的mRNA表达水平显著下降。结论:1.小檗碱重塑了一种特殊的肠道菌群结构并改善了肠屏障功能。2.小檗碱可以有效的改善PCOS模型大鼠的代谢和生殖功能,其机制可能与改善肠道屏障功能,抑制TLR-4/MyD88/NF-κB信号通路,降低炎症反应有关。