背景及目的自然杀伤/T细胞淋巴瘤（natural killer/T-cell lymphoma,NKTCL）是一种高度侵袭性的非霍奇金淋巴瘤,病情进展快,生存期短,预后较差。目前化疗是进展期NKTCL的主要治疗手段,但相较B细胞淋巴瘤,整体疗效较差。NKTCL对传统的CHOP化疗方案并不敏感,患者5年总生存率低于50%,考虑可能和P-糖蛋白介导的多药耐药有关。现常用的以门冬酰胺酶为基础的化疗方案虽然可一定程度提高疗效,但仍有约30%的患者在一年内病情进展或复发,提示NKTCK细胞有更为复杂的耐药机制。为了改善NKTCL的治疗现状,寻找理想的诊断标记物和治疗靶点,研究者在许多生物学机制方面开展了对NKTCL的研究,如染色体位点缺失、抑癌基因失调、增殖相关信号通路激活、免疫检查点异常和表观遗传学改变等,但针对NKTCL的靶向治疗和免疫治疗尚需更多临床前或临床研究的转化,且由于患者个体差异和并发症,目前应用受限。所以,深入了解NKTCL细胞生物学特性,明确化疗耐药机制,仍是提高NKTCL化疗疗效最重要的问题。本课题组前期基于阿霉素耐药的NKTCL细胞系,分选出侧群（side population,SP）细胞。这类细胞进化保守,表达干细胞标记CD133、Nanog和耐药相关蛋白磷酸腺苷结合转运蛋白G超家族成员2（ATP binding cassette subfamily G member 2,ABCG2）。这部分SP细胞主要体现为:1、比普通NKTCL细胞和阿霉素耐药NKTCL细胞更强的化疗耐药性;2、干细胞样特性。肿瘤干细胞（Cancer Stem Cells,CSCs）是由SP细胞分选而来,二者在实验技术和作用机制上多有重叠。近来研究表明,CSCS与淋巴造血系统肿瘤疾病发生发展密切相关,许多生物学特性可能都和CSCS的分化有关,相较普通肿瘤细胞或其他非干细胞,表观遗传调控在CSCS中可能具有更为关键的作用。RNA的N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine,m6A）已被证明能够维持胚胎干细胞的多能性、参与造血干细胞的谱系分化、甚至将体细胞重编程为多能干细胞,也能富集乳腺癌CSCS和促进白血病CSCS的转化。因此,RNA的m6A修饰在CSCS的生物学功能调控中发挥重要作用。烷基化修复同源蛋白5（ALKB homolog 5,ALKBH5）是第二个被发现的m6A去甲基酶,已有报道其在血液系统肿瘤中发挥重要作用。ALKBH5可作为MYC的靶基因参与B细胞淋巴瘤发生。ALKBH5在急性髓系白血病中表达升高,参与维持白血病CSCS干性基因的表达,也可通过调控TACC3和受体酪氨酸激酶AXL促进病程进展,而AXL与白血病细胞耐药密切相关。由此可见,ALKBH5可能在淋巴血液系统恶性肿瘤及其CSCS的发生发展特别是耐药机制发展中发挥重要作用。鉴于目前尚无ALKBH5在NKTCL中的研究,我们拟探索ALKBH5在NKTCL及其SP细胞发生发展中的功能及相关耐药机制。本课题围绕ALKBH5在NKTCL及其SP细胞发生发展的作用和机制,开展了一系列研究。首先免疫组化分析ALKBH5在NKTCL肿瘤组织中的表达及临床意义;随后,利用已构建的NKTCL SP细胞,研究ALKBH5在NKTCL SP细胞的生物学功能作用;转录组测序、免疫荧光和通路调节剂探索其影响的相关通路,并重点筛选并鉴定NKTCL SP细胞中耐药相关基因ABCG2以及相关联信号通路,利用双荧光素酶标记和Western blotting等明确和ABCG2的相互作用关系;体内和体外实验分别探究ABCG2在SP细胞化疗耐药产生中的作用机制;最后构建裸鼠移植瘤模型,对ALKBH5在NKTCL SP细胞中的作用和对ABCG2的调控机制进行进一步的体内验证,并分析靶向ALKBH5对化疗敏感性的影响。本研究以m6A修饰的角度阐述NKTCL发生发展的可能分子机制,丰富NKTCL复杂的耐药产生机制,为NKTCL SP细胞相关的生物学功能提供理论基础,为未来临床克服化疗耐药提供潜在的治疗靶点。第一部分 ALKBH5在NK/T细胞淋巴瘤中的表达和临床意义方法收集初治NKTCL组织,选取淋巴结反应性增生组织蜡块作为对照,免疫组化法（immunohistochemical,IHC）检测和评估ALKBH5在各组织中的表达并分析其临床意义。结果NKTCL组织中ALKBH5表达显著高于淋巴结反应性增生组织（P=0.002）。相较ALKBH5低表达患者,高表达患者Ann Arbor分期较晚（P=0.001）,总生存期（P=0.018）和无进展生存期（P=0.025）明显减少。ALKBH5高表达（P=0.048）是患者总生存的独立不良预后因素。小结1.ALKBH5在NKTCL组织较淋巴结反应性增生组织中表达升高,且与NKTCL患者Ann Arbor分期有关。2.ALKBH5是影响NKTCL患者总生存的独立不良预后因素。第二部分 ALKBH5在NK/T细胞淋巴瘤侧群细胞中表达调控、生物学功能及作用机制的探讨1.酶标仪比色法检测NKTCL细胞系（YT、SNK-6、KHYG-1）和NKTCL SP细胞系（YT-SP、SNK-6-SP、KHYG-1-SP）中m6A含量。2.qRT-PCR法检测m6A修饰酶在NKTCL及其SP细胞中的表达。3.采用慢病毒转染的方法构建YT-SP细胞和SNK-6-SP细胞的ALKBH5过表达细胞（Lv-ALKBH5）、干扰表达细胞（Sh-ALKBH5）及对照组细胞（Lv-NC和Sh-NC）,并用qRT-PCR和Western blotting方法进行验证。4.检测ALKBH5对YT-SP和SNK-6-SP细胞生物学特性的改变:CCK-8和EDU法检测增殖;Annexin V法检测凋亡;Transwell小室检测迁移。5.转录组测序检测YT-SP-Sh-ALKBH5细胞和YT-SP-Sh-NC细胞的差异基因并富集分析,推测ALKBH5可能影响的信号通路,并应用免疫荧光、qRT-PCR、双荧光素酶标记、Western blotting和相应通路调节剂对ABCG2相关通路进行验证。结果1.NKTCL SP细胞m6A的含量较NKTCL细胞减少（P＜0.0001）。2.ALKBH5在NKTCL SP细胞的mRNA和蛋白表达量较NKTCL细胞升高（P＜0.0001）。3.慢病毒转染并稳定传代的YT-SP和SNK-6-SP细胞中Lv-ALKBH5组的ALKBH5 mRNA和蛋白质表达量均较Lv-NC组显著升高（P＜0.001）,Sh-ALKBH5组的ALKBH5 mRNA和蛋白质表达量均较Lv-NC组显著降低（P＜0.01）。4.过表达和下调ALKBH5的NKTCLSP细胞的生物学功能检测结果:YT-SP和SNK-6-SP细胞中Lv-ALKBH5组均较Lv-NC组增殖率增加（P＜0.01）、EdU阳性率增加（P＜0.001）、细胞凋亡率降低（P＜0.01）和细胞迁移数增多（P＜0.001）;Sh-ALKBH5组均较Sh-NC组增殖减慢（P＜0.05）、EdU阳性率降低（P＜0.0001）、凋亡率升高（P＜0.01）和迁移能力减弱（P＜0.01）。5.转录组测序显示:与YT-SP-Sh-NC组相比,YT-SP-Sh-ALKBH5组差异基因在Wnt/β-catenin信号通路富集,且该通路转录因子（transcription factor 4,TCF4）下调。免疫荧光验证YT-SP-Sh-ALKBH5组中Wnt通路蛋白β-catenin和TCF4较YT-SP-Sh-NC组下调（P＜0.0001）。综合课题组前期ABC家族蛋白检测结果和差异基因富集分析结果得出,ALKBH5可能通过Wnt/β-catenin信号通路调控ABCG2。qRT-PCR验证ABCG2在YT-SP细胞表达较YT细胞显著升高（P＜0.05）,Western blotting检测显示Wnt/β-catenin通路抑制剂可降低YT-SP细胞ABCG2的蛋白表达。双荧光素酶标记实验检测TCF4与ABCG2启动子区结合并上调其表达（P=0.0012）。6.通路激动剂结果显示:相比YT-SP-Sh-NC组细胞,YT-SP-Sh-ALKBH5细胞TCF4和ABCG2表达均降低,且细胞增殖能力减弱,凋亡增多（P＜0.0001）;应用Wnt通路激动剂处理YT-SP-Sh-ALKBH5细胞后,相比未加药组YT-SP-Sh-ALKBH5细胞,TCF4和ABCG2蛋白表达升高,细胞增殖能力增强,凋亡减少（P＜0.0001）。小结1.相较NKTCL细胞,ALKBH5在NKTCL SP细胞中表达升高,可引起SP细胞RNAm6A修饰水平降低,SP细胞增殖和迁移能力增强,凋亡减弱。2.ALKBH5可通过Wnt/β-catenin/TCF4信号通路正向调控ABCG2;干扰ALKBH5造成的TCF4和ABCG2蛋白表达的下调和生物学特性的改变可被Wnt信号通路激动剂恢复。第三部分 ALKBH5调控靶点ABCG2介导的NK/T细胞淋巴瘤侧群细胞多药耐药研究方法1.免疫荧光和Western blotting检测ABCG2在SNK-6-SP细胞中的表达。2.采用慢病毒转染的方法构建SNK-6-SP细胞的ABCG2过表达（Lv-ABCG2）、干扰表达（Sh-ABCG2）及其对照细胞（Lv-NC和Sh-NC）,并用qRT-PCR和Western blotting方法进行验证。3.CCK-8方法检测NKTCL化疗药（阿霉素、阿糖胞苷,顺铂、吉西他滨和左旋门冬酰胺酶）对Lv-ABCG2和Sh-ABCG2细胞的IC50值。4.ABCG2抑制剂Pelitinib处理Lv-NC和Lv-ABCG2细胞,CCK-8法检测阿霉素和吉西他滨的IC50值。5.吉西他滨处理Lv-NC和Lv-ABCG2细胞,检测生物学特性的改变:Annexin V法检测凋亡;克隆实验检测克隆形成;Western blottinging方法检测凋亡相关蛋白。6.使用BALB/c裸鼠和Lv-NC和Lv-ABCG2组细胞构建NKTCL小鼠皮下移植瘤模型,检测ABCG2对吉西他滨药敏性的影响。结果:1.SNK-6-SP细胞较SNK-6细胞,ABCG2蛋白表达量显著升高（P＜0.001）。2.慢病毒转染并稳定传代的SNK-6-SP细胞Lv-ABCG2组较Lv-NC组,ABCG2 mRNA和蛋白质表达显著升高,Sh-ABCG2较Sh-NC组ABCG2 mRNA和蛋白质的表达量降低（P＜0.001）。3.Lv-ABCG2组较Lv-NC组,阿霉素、阿糖胞苷、顺铂和吉西他滨的IC50值显著升高（P＜0.0001）,而L-天冬酰胺酶的IC50值无差异（P=0.0822）;Sh-ABCG2组较Sh-NC组阿霉素、阿糖胞苷,顺铂和吉西他滨的IC50值显著降低（P＜0.0001）,而L-天冬酰胺酶的IC50值无差异（P=0.6952）。4.ABCG2抑制剂Pelitinib能降低阿霉素和吉西他滨对SNK-6-SP细胞的IC50值（P＜0.001）。5.相比Lv-NC组,Lv-ABCG2组能抵抗吉西他滨杀伤作用,克隆形成能力增强,凋亡能力减弱（P＜0.001）。6.ABCG2能够抵抗吉西他滨对NKTCL SP移植瘤的杀伤作用,Lv-ABCG2组相比Lv-NC对照组,瘤体积和瘤重量显著增大（P＜0.05）。小结1.相较NKTCL细胞,ABCG2在NKTCLSP细胞中表达升高。2.ABCG2能增加NKTCL SP细胞对阿霉素、阿糖胞苷、顺铂和吉西他滨的耐药性,对L-天冬酰胺酶无影响;Pelitinib能够抑制ABCG2所致的耐药性。3.ABCG2能够抵抗吉西他滨的杀伤作用,增强NKTCL SP细胞的克隆形成能力、减弱凋亡能力、促进裸鼠皮下移植瘤形成。第四部分 ALKBH5在NK/T细胞淋巴瘤侧群细胞中生物学功能和机制的体内研究方法1.构建移植瘤模型对ALKBH5在NKTCL SP细胞中的功能和机制进行验证1.1.使用YT-SP的ALKBH5各组转染细胞构建裸鼠皮下移植瘤。1.2.小鼠移植瘤模型成功后,每天观察小鼠一般状态,记录肿瘤体积和鼠重。小鼠最大体积达2000mm3,处死小鼠,剥瘤并称重。1.3.对Sh-NC和Sh-ALKBH5组鼠瘤进行HE染色检测,IHC法检测NKTCL表面标记物CD56和Perforin;IHC法检测Ki-67、β-catenin和ABCG2蛋白表达。2.构建移植瘤模型评估靶向ALKBH5对化疗敏感性的影响使用YT-SP的Sh-NC和Sh-ALKBH5细胞株构建裸鼠皮下移植瘤。接种第9天后吉西他滨腹腔注射给药,每周两次,比较吉西他滨对Sh-NC和Sh-ALKBH5小鼠治疗前后肿瘤体积的变化。结果1.Lv-ALKBH5组较Lv-NC组的小鼠瘤体和瘤重明显增加,Sh-ALKBH5组较Sh-NC组的小鼠肿瘤体积和重量明显减少（P＜0.01）。HE染色显示恶性肿瘤的一般特征,CD56 和Perforin阳性。Sh-ALKBH5 组Ki-67、ALKBH5、β-catenin和ABCG2的蛋白表达量较Sh-NC组明显降低。2.Sh-ALKBH5组小鼠的肿瘤体积较Sh-NC组明显减少。小结ALKBH5可促进NKTCL SP细胞移植瘤形成。干扰ALKBH5能抑制Wnt/β-catenin/ABCG2相关蛋白的表达,抑制小鼠肿瘤生长,提高肿瘤细胞化疗敏感性。全文结论1.ALKBH5在NKTCL患者肿瘤组织中表达升高,是影响NKTCL患者总生存的独立不良预后因素。2.ALKBH5能增加NKTCL SP细胞的增殖和迁移能力,抑制凋亡,与NKTCL恶性生物学功能密切相关;ALKBH5通过Wnt/β-catenin信号通路调控ABCG2介导了NKTCL SP细胞多药耐药产生。3.靶向ALKBH5可以抑制肿瘤生长,提高化疗敏感性,是NKTCL潜在治疗靶点。