研究背景我国鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma, NPC)发病地区多集中于南方沿海城市,发病特点具有种族易感性,家族遗传以及明显的地区聚集发病性。NPC发病因素复杂,属于多基因遗传性疾病(polygenetic diseases),且受多种因素作用,包括EB病毒感染、遗传因素、饮食习惯以及环境因素等多种因素作用相关。但迄今鼻咽癌的确切发病机制不清。病毒感染尤其是EB病毒感染是目前公认的鼻咽癌发病因素之一。中国南方鼻咽癌患病人群中大多都检测到EB病毒基因组。鼻咽癌的组织发生源于鼻咽粘膜被覆上皮和陷窝柱状上皮,病理分型方法较多,在国内分型方法主要是将鼻咽癌根据分化程度分为低分化鳞癌,中分化鳞癌和高分化癌以及未分化癌、腺癌和泡状核细胞癌。鼻咽癌大多对放射治疗具有中度敏感性,放射治疗是鼻咽癌的首选治疗方法。但是对较高分化癌,病程较晚以及放疗后复发的病例,手术切除和化学药物治疗亦属于不可缺少的手段。但是由于鼻咽部构成复杂,发病部位较深且隐蔽,增加了治疗难度,同时缺乏个体化特异性治疗方式和药物,治疗方式较为单一,因此对鼻咽癌的治疗效果仍旧不佳,5年生存率始终不高。临床上由于鼻咽癌的进展过程、患者病变严重程度及身体免疫能力各自不同,因此对放化疗敏感性不同,进一步导致治疗效果存在较大差异。因此寻找鼻咽癌的分子标志物将有利于鼻咽癌的早期诊断,个体化治疗以及预后的评估。Nemo样激酶(Nemo-like kinase, NLK)是一种保守的丝/苏氨酸蛋白激酶,在细胞凋亡、炎症信号转导、肿瘤细胞增殖以及机体代谢等过程和多个信号通路中发挥重要作用。在前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、神经胶质瘤以及结直肠癌中具有抑制肿瘤发生发展的作用,而在肝癌、胆囊癌、口腔鳞腺癌中具有促进了肿瘤进展的作用。NLK由于可以参与胚胎发育、骨的形成与生长并可影响到生物节律性,而且和肿瘤的发生发展密切相关,因此备受生物学及医学领域的重视。尤其是NLK在肿瘤中的双面性格日益引起关注。NLK在NSCLC即非小细胞肺癌组织中的表达降低,较正常肺组织具有显著差异,说明非小细胞肺癌发生后,抑制NLK的表达,而β-catenin/TcF复合物表达明显升高,Wnt的下游蛋白CycD1、c-Myc和DDK1、Axin2表达增加,说明NLK表达下降,通过抑制Wnt通路参与调控非小细胞肺癌。NLK转移性前列腺癌中的表达,低于原位前列腺癌,在前列腺癌细胞系的研究中发现,NLK表达增加或过表达,可以诱导前列腺癌细胞的凋亡,NLK基因表达的更加,促进雄激素受体转录活性的降低,肿瘤生长也受到抑制；抑制内源性NLK的表达可以增加雄激素受体介导的转录活性；反之,NLK的表达在增加,抑制激素受体介导的转录活性。从而说明NLK表达通过调控雄激素受体通路而抑制前列腺癌的发生和发展。NLK与雄激素受体通路的具体机制尚未完全阐明。NLK同样在卵巢癌组织样本中检测到表达降低,同时和肿瘤的分期及分级相关。NLK表达降低预示卵巢癌预后不良。因此Wnt通路可能参与卵巢癌的发生。而卵巢癌对化疗药物如顺铂的敏感性也和NLK表达相关。抑制p38活性,NLK对卵巢癌对化疗药物如顺铂的敏感性调控作用降低,说明NLK可能通过p38通路发挥卵巢癌细胞对顺铂的敏感性调节。NLK在神经胶质瘤的研究被认为同样发挥抑制肿瘤发生的作用,在低级别的星形细胞瘤表达明显高于在高级间变星形细胞瘤和多形性成胶质细胞瘤中的表达,而NLK表达低的神经胶质瘤患者生存期明显低于高表达患者。在神经胶质瘤细胞株中过表达NLK后,神经胶质瘤细胞中半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase-3)表达也升高,提示NLK可能是通过活化天冬氨酸蛋白水解酶(caspase-3)通路调控神经胶质瘤细胞的凋亡。NLK表达可以抑制结肠癌细胞株的生长,将NLK转染入结肠癌细胞株后抑制结肠癌细胞的生长,增殖,使肿瘤细胞停滞在G1期,说明NLK可通过影响细胞周期对结肠癌细胞产生影响,诱导肿瘤细胞凋亡,同样检测了转染NLK后,β-catenin/TcF复合体的数量,以证实是否可以通过抑制β-catenin/TcF复合体形成诱导凋亡,结果并未出现变化,说明NLK对结肠癌细胞的影响不是通过β-catenin/TcF复合体发挥作用。NLK在乳腺癌的表达研究中,证实其过表达可以抑制乳腺癌细胞的增殖并诱导凋亡。在乳腺癌的肿瘤组织中可检测到其表达与临床分级和ki-67, c-Myb呈负相关。c-Myb具有致癌性,而ki-67促进细胞增殖,在细胞分裂的G期和S期高表达,在乳腺癌细胞培养中,可检测到NLK表达在G1期增加,c-Myb在G0期和G1期下降,S期表达增加,NLK可能与磷酸化的c-Myb结合,降解c-Myb,使其靶基因c-Myc和Bcl-2表达降低,阻滞细胞周期,NLK通过阻滞细胞周期诱导细胞凋亡,抑制乳腺癌的发生。NLK在肝癌组织中的表达是正常组织的2倍以上,说明NLK在肝癌中发挥促癌功能,将肝癌细胞中NLK表达沉默后,可以明显抑制其肿瘤细胞的生长。G1-S期细胞增多,但肝癌细胞凋亡并未明显增加,NLK表达降低,CyclinD1和CDK1的表达降低,因此可能是NLK改变G/S期细胞而并非诱导凋亡。敲除NLK后可以抑制β-catenin的表达,从而说明NLK在肝癌细胞中的促进肿瘤发生发展的作用。NLK在胆囊癌的研究中发现同样可以促进肿瘤的进展,在胆囊癌细胞株中抑制NLK表达后,可明显降低肿瘤细胞的增殖,肿瘤生成能力也被抑制,细胞株的迁移能力也受到抑制,但是其机制尚不明确。在口腔鳞癌的研究中发现NLK在口腔癌细胞株中被干扰抑制后可以抑制细胞增殖以及肿瘤形成,主要阻滞细胞周期从G0/G1期到S期的过渡,说明NLK可能是通过干预细胞周期而促进口腔癌的发展。NLK在肝细胞癌、结直肠癌、卵巢癌、前列腺癌、胆管癌及胶质瘤等多种恶性肿瘤的发生和发展中扮演抑癌基因或促癌基因的重要作用,可能与肿瘤的来源及性质有关。但NLK在鼻咽癌中的表达和作用尚未研究,NLK是否可以作为鼻咽癌的诊断标志有待进一步探讨。研究方法1收集352例初始鼻咽癌患者的鼻咽癌样本,以及176例癌旁组织。收集患者的临床资料(年龄、性别、病理类型、初发症状分布、转移淋巴结,患者的临床分期)。所有患者在收集前未进行手术,根据临床记录确定患者死因。2苏木素-伊红(HE)染色观察确定肿瘤分级。3利用SABC免疫组化方法检测NLK在鼻咽癌的表达情况。4利用Cox单因素和多因素回归分析NLK与鼻咽癌DFS和OS的相关性。5 Kaplan-Meier生存分析曲线分析NLK与鼻咽癌DFS和OS的相关性。6体外培养人类鼻咽癌细胞系CNE2细胞株。7 siRNA干扰NLK在鼻咽癌细胞中的表达。8 Real time PCR检测NLK在鼻咽癌细胞中mRNA的表达变化。9采用Western Blot检测鼻咽癌细胞中NLK蛋白水平表达变化。10 MTT细胞增殖实验检测NLK对鼻咽癌细胞增殖情况的影响。11平板克隆形成实验检测NLK对鼻咽癌细胞的克隆形成率的影响。12细胞划痕实验(迁移实验)检测NLK对鼻咽癌细胞迁移能力的影响。13 Transwell小室侵袭实验检测NLK对鼻咽癌细胞侵袭能力的影响。MTT检测siRNA干扰NLK后对细胞增殖的影响；克隆形成试验检测对肿瘤细胞克隆形成的影响。细胞划痕试验和Transwell小室检测NLK对鼻咽癌细胞迁移和侵袭能力的影响。14 Caspase 3活性检测NLK对鼻咽癌细胞凋亡的影响。研究结果1收集的352例鼻咽癌患者临床资料进行分析,其中包括男性204例,女性148例,年龄12-69岁,平均年龄(45.2±17.9)岁,肿瘤TNM分期可见,肿瘤大小以T4期为主,共144例,占所有收集患者的40.9%,其次为T2和T3期患者。从局部淋巴结情况分析,多数患者处于N2-N3期,227例,占64.5%,其余的患者为N0-N1期患者。而远距离转移情况可见,多数患者处于M0期,223例,占63.4%,其余患者为M1期患者。TNM分期处于Ⅰ-Ⅱ患者101例,多数患者为Ⅲ-Ⅳ期患者251例,占71.3%。2 NLK阳性表达主要在细胞核内。在352例鼻咽癌肿瘤样本中,共190例患者肿瘤样本表达NLK,占54%,而NLK表达阴性的患者为162例,占46%。而NLK在176例鼻咽癌的癌旁组织中均不表达。3 NLK表达与鼻咽癌患者的性别无统计学差异(P=-0.79)。NLK表达与鼻咽癌的组织类型包括未分化以及非角质组织型无统计学差异(P=0.58)。4局部淋巴结和NLK表达的关系分析中表明,二者有有显著性差异(P=0.003)。而远处转移和NLK表达的关系分析中表明,二者有显著性差异(P<0.001)。与肿瘤的大小和NLK表达的关系分析,二者有显著性差异(P=0.016)。说明NLK在鼻咽癌中的表达和TNM分期存在相关。5在286例随访鼻咽癌患者中,随访期间共134例患者复发,占46.9%。利用Cox单因素回归分析,在NLK阳性鼻咽癌患者中复发风险是NLK表达阴性患者的3倍(危险比hazard ratio (HR)=2.94,95%可信区间confidence interval(95%(CI)=1.30-6.52,P=0.011)。因此,除了TNM分期以及肿瘤程度可以预测DFS情况(P=0.034；P=0.014),在鼻咽癌患者中NLK过表达预示着其无病生存期(DFS)短,预后不良。而鼻咽癌患者的无病生存期(DFS)与患者性别、年龄等一般临床资料无关。同时与患者肿瘤组织类型和患者的淋巴结情况无关6利用Kaplan-Meier生存分析方法进行分析,NLK表达阳性的鼻咽癌患者DFS显著变短,与NLK表达阴性的鼻咽癌患者比较,具有统计学差异(P=0.0012)。7多因素生存分析NLK表达阳性的鼻咽癌患者具有显著的无病生存期缩短,独立于其他因素,NLK蛋白阳性的鼻咽癌患者更容易复发(HR=3.46,95%CI=0.96-5.87,P=0.013)。而其他因素包括患者性别、年龄等一般临床资料和复发以及DFS无相关性,同时与患者肿瘤组织类型和肿瘤大小程度、患者的淋巴结、TNM分级情况均无关。8在可随访到的286例鼻咽癌患者中,117例患者死于随访期间,占40.9%。Cox单因素回归分析显示,NLK表达阳性的鼻咽癌患者死亡风险明显增加,与NLK表达阴性的鼻咽癌患者死亡风险比较,差异具有统计学意义(HR=2.77,95% CI=1.12-5.98, P=0.011)。强阳性的鼻咽癌患者总生存期不佳。肿瘤程度和TNM分期也是总生存期的显著预测因子(P=0.034和P=0.014)。9利用Kaplan-Meier总生存期曲线分析显示,NLK表达阳性的鼻咽癌患者预后差,与NLK表达阴性的鼻咽癌患者预后比较,差异具有统计学意义(P<0.001)10在Cox多因素回归分析显示,NLK表达阳性的鼻咽癌患者预后结果差,具有显著的统计学差异(HR=2.77,95% CI=1.12-5.98, P=0.011)。在经过患者性别,年龄,肿瘤组织学和TNM分期的调整后的Cox多因素回归分析,在鼻咽癌患者中,NLK表达阳性的是独立的诊断因子(HR=3.15,95% CI=1.33-7.84, P=0.019)。11 Kaplan-Meie生存分析评估无远处转移的NLK表达阳性的鼻咽癌患者的DFS和总生存期,M0期NLK表达阳性的鼻咽癌患者的DFS和总生存期明显缩短,与M0期NLK表达阴性的鼻咽癌患者比较,具有统计学差异(P<0.001和P=0.009)12 siRNA干扰NLK后,使NLK表达受到抑制,NLK mRNA表达减少,与对照组比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。13 siRNA干扰NLK后,使NLK表达受到抑制,NLK蛋白表达明显减少。14 siRNA干扰NLK后,NLK表达减少,可明显抑制肿瘤细胞的增殖,与对照组比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。15 siRNA干扰NLK后,NLK表达减少,可明显减少肿瘤细胞的克隆形成,与对照组比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。16 siRNA干扰NLK后,NLK表达减少,肿瘤细胞迁移受到抑制,迁移率明显减少,与对照组比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。17 siRNA干扰NLK后,NLK表达减少,肿瘤细胞迁移明显受到抑制,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。18 siRNA干扰NLK后,NLK表达减少,虽肿瘤细胞Caspase活性有所减少,但与对照组比较,无统计学差异。结论1 NLK可以作为鼻咽癌诊断的独立预测生物学标志。2鼻咽癌组织中NLK阳性表达DFS和OS显著变短,容易复发,预后不良。3 NLK促进鼻咽癌细胞增殖和克隆形成。4 NLK增强鼻咽癌细胞侵袭和迁移能力。5 NLK不影响鼻咽癌细胞的凋亡