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目前,我国用于生产酸奶的直投式发酵剂多为进口。开发、生产具有我国自主知识产权的高活性、低成本酸奶直投式发酵剂备受国内学者关注。直投式酸奶发酵剂的开发与生产需要经过优良菌种的筛选和选育,菌株的增殖培养,菌体的浓缩分离与收集,菌体的冷冻干燥与保护等重要环节。筛选发酵性能优良、活力较高、能够制备高品质酸奶的菌种是开发、生产直投式发酵剂的前提。德氏乳杆菌保加利亚亚种(通常简称为：保加利亚乳杆菌)作为生产酸奶的主要菌种之一,通过发酵鲜奶产酸、产胞外多糖以及特征性风味物质,赋予酸奶独特的风味、良好的质地和细腻的口感。优良保加利亚乳杆菌同时具备发酵产酸速度快、贮藏期间后酸化弱、制备的酸奶黏度高、感官品质评价好等特点。菌体高密度培养是开发、生产直投式发酵剂的关键。通过培养基的改良、培养条件的优化实现保加利亚乳杆菌的菌体增殖,使其活菌数在液体培养基中可达109CFU/mL以上,从而接近国际水平。本课题对重点实验室前期鉴定的德氏乳杆菌保加利亚亚种进行优选,并对优选菌株的高密度培养基进行了研究,为菌株开发成直投式酸奶发酵剂奠定基础。通过16S rRNA基因序列的分析,对实验菌株L1、L7、L12、L15重新进行分子生物学鉴定,证实用于实验的菌株均为德氏乳杆菌保加利亚亚种。在100g/L的脱脂乳中,对实验菌株产酸速率、后酸化程度进行测定,菌株L7的产酸速率最快为13.4oT/h、菌株L12其次、菌株L1最为缓慢仅为6.0°T/h；在不同温度条件下贮藏测定各菌株的后酸化特性,结果显示：低温贮藏可以有效抑制菌株的后酸化现象,其中菌株L7后酸化最为严重、菌株L15低温贮藏期间后酸化程度最弱。为了进一步筛选优良菌株,使用单菌株、组合菌株发酵酸奶,并对酸奶的酸度、质构及感官进行评价。不论是单菌株间酸奶品质评价,还是组合菌株间酸奶品质的评价都显示实验菌株L7、菌株L15制作的酸奶黏度高、口感好且香味浓厚,其中L15S1组合、L7S1组合制作的酸奶与市售酸奶口感风味较为接近,完全具备开发成酸奶发酵剂的前提。通常情况下,应用在保加利亚乳杆菌高密度培养的基础培养基是MRS、乳清粉或脱脂乳。其中MRS成本较高、乳清粉营养不足、脱脂乳虽然营养全面但不宜于后期的菌体分离。为了降低培养基的成本、提高活菌数且便于菌体分离,采用6%的酶解脱脂乳为基础培养基,通过添加乳清粉补充碳源和部分氮源、添加酵母粉补充多种促生长因子、添加碳酸钙中和发酵液中的乳酸,从而实现菌体的高密度培养。通过最陡爬坡实验按梯度添加乳清粉、酵母粉和碳酸钙,以最快的速度逼近优选保加利亚乳杆菌菌株L7、菌株L15菌体收获最高密度的区域。使用Design Expert8.05b软件的Box-Behnken设计三因素三水平响应面优化实验,并通过标准多项式回归方法,对实验数据进行拟合,得到一个二次多项式,进一步建立二次响应面回归模型,可用以下模型方程来表示在6%酶解脱脂乳基础培养基中添加不同量的乳清粉、酵母粉、碳酸钙得到的12h菌株L7活菌数：Y=178.80+16.63A+0.13B+14.75C-0.50AB-5.75AC+11.75BC-61.40A2-19.90B2-22.15C2同理,菌株L15在18h获得的活菌数拟合模型方程为：Y=350.60+22.13A+19.25B+8.88C-7.75AB-2.00AC+23.25BC-27.55A2-32.80B2-27.05C2进一步对改良培养基在更大范围内进行优化,其中乳清粉的取值范围是20g/L-80g/L、酵母粉的取值范围是5g/L-20g/L、碳酸钙的取值范围是1.0g/L-5.0g/L时,分别以菌株L7在12h和菌株L15在18h获得的最高活菌数为目标,对各因素最低的添加量进行优化,得到菌株L7高密度培养的最佳培养基是在6%的酶解脱脂乳中添加49.14g/L的乳清粉、6.63g/L的酵母粉和1.51g/L的碳酸钙；菌株L15高密度培养的最佳培养基是在6%的酶解脱脂乳中添加58.21g/L乳清粉、10.44g/L的酵母粉和2.43g/L的碳酸钙。在这两种培养基中,恒温42℃、搅拌80rpm、40%氨水流加恒pH值为5.8时,菌株L7最高活菌数可达1.55×109CFU/mL、菌株L15最高活菌数可达3.24×109CFU/mL均达到了国际平均水平。