基于DNA聚合酶的DNA复制和扩增反应,是分子生物学研究中至关重要的技术手段之一。在溶液环境中研究DNA聚合酶与核酸的相互作用过程,对于更加深入地认识和理解DNA聚合反应具有重要意义。与传统的蛋白质表征方法相比,纳米孔单分子传感器能够在溶液环境下实时且无标记地表征蛋白质的构象变化和动力学过程,具有显著的技术优势和重要的应用潜力。本课题利用孔径约为35 nm的氮化硅固态纳米孔传感器,检测DNA聚合酶I Klenow大片段（KF）、KF-DNA二元复合体以及Klenow大片段与不同DNA底物混合孵育产物的易位事件,分析Klenow大片段在结合底物前后的构象变化和传输动力学特征,并探究底物中的碱基错配以及制备样品时聚合酶与底物的浓度比例对聚合酶结合底物效率的影响。本课题的主要研究内容如下:1.搭建基于固态纳米孔的单分子检测平台利用聚焦离子束和透射电子束,分别加工孔径约30 nm和孔径20 nm以下的氮化硅固态纳米孔,用于搭建单分子检测平台。基于现有分析方法与模型,利用孔径约为13 nm的固态纳米孔传感器,探究单链DNA与发夹结构DNA的结构特征,验证固态纳米孔对DNA构象的辨识能力,为后续实验建立完整的检测分析流程。结果表明,发夹结构DNA过孔时花费更短的时间、引起更小的电流变化、产生更单一的信号,对应其自身更加稳定的构象及更为简单的易位行为。2.研究“蛋白质-核酸”二元复合体的结构特征利用孔径约为35 nm的固态纳米孔传感器,表征Klenow大片段和KF-DNA二元复合体的构象和传输动力学特征。构象特征结果表明,与底物结合之后,Klenow大片段的水动力半径减小约0.36 nm,构象柔韧性降低。传输动力学特征指出,体积更小、结构更紧凑的二元复合体更难被纳米孔捕捉且更不易过孔。通过比较不同类型过孔信号的数量占比可知,由于裸露模板链的干扰和二元复合体与孔壁之间的强相互作用,二元复合体具有更加复杂的易位行为。3.探究影响聚合酶结合DNA底物效率的因素利用孔径约为35 nm的固态纳米孔传感器,设计带有不同粘性末端的DNA底物,探究底物中的碱基错配和制备样品时聚合酶与底物的浓度比例对聚合酶结合底物效率的影响。结果表明,当底物引物链3’端带有错配碱基时,Klenow大片段对其结合效率降低;随着聚合酶浓度比例的增加,Klenow大片段对底物的结合效率有所提高。